酶电极法快速测定加热卷烟中的甘油含量

赵德清 ，邓永，郭林青，史健阳，王帅鹏，梁坤，韩咚林，黄玉川

1 四川中烟工业有限责任公司，新型烟草研发中心，成都市锦江区成龙大道一段56号 610066；

2 四川三联新材料有限公司，新型烟草事业部，成都市锦江区成龙大道一段56号 610066

在新型烟草制品领域，加热卷烟已经成为全球烟草行业未来最具发展潜力的研究热点[1]。传统卷烟的烟气气溶胶是通过燃烧产生的，加热卷烟的气溶胶是在300℃左右的加热温度下通过发烟剂雾化产生的，甘油是加热卷烟气溶胶中的主要组分，也是加热卷烟所用烟芯材料的主要发烟剂成分。甘油含量的大小及其稳定性显著影响加热卷烟的感官质量以及烟芯材料的质量稳定性，因此，快速检测加热卷烟或加热卷烟用烟芯材料中的甘油含量，是加热卷烟研究领域的一项基本需求。

烟草及烟草制品中甘油的检测方法主要有气相色谱法[2-7]、高效液相色谱法[8-9]、气相色谱-质谱联用法[10-11]、拉曼光谱法[12]等。发酵领域发酵液中甘油含量的测定方法有高碘酸氧化法[13-14]、分光光度法[15]、甘油激酶法[16]等。这些方法样品前处理操作步骤比较繁琐，较为快速的甘油检测试剂盒成本较高。酶电极分析法是利用酶固定化技术将酶蛋白分子制成固定化酶膜，再与电化学基础电极相结合，构成酶电极生物传感器用于特异性底物分析的一项生物技术。该方法具有专一性高、稳定性好、检测快速灵敏等特点。酶电极法在食品、发酵、医学等领域得到了较为广泛的应用[17-19]，目前在烟草行业尚未见报道。本文建立了一种基于生物传感器的酶电极分析法，可实现加热卷烟中甘油含量的快速准确检测，旨在为加热卷烟及加热卷烟用烟芯材料中甘油含量的调控提供基础检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

材料：所选加热卷烟样品基本涵盖了国内外主流加热卷烟品牌，主要包括四种：（1）菲莫公司IQOS加热卷烟Marlboro HeatSticks 系列和Heets 系列；（2）英美烟草公司Glo 系列；（3）韩国KT&G 公司lil 系列；（4）四川中烟自制加热卷烟产品“宽窄EVO”系列，共计22 个样品，具体样品信息表见表1。

表1 加热卷烟样品信息表Tab. 1 Information of HTP cigarette samples

仪器与试剂：M-100 型生物传感器分析仪（深圳西尔曼科技有限公司）；PerkinElmer Clarus 500 气相色谱仪（美国PE 公司，配备FID 氢火焰检测器和氢气发生器）；SM450 直线型吸烟机（英国Cerulean公司）；HY-8 型调速震荡仪（昆山超声波清洗有限公司）；分析天平AG104（0.1 mg，瑞士梅特勒托利公司）；0.45 μm有机相滤膜（上海迅同机械有限公司）。甘油标准液（1.0 g/L）、甘油酶膜、缓冲剂由深圳西尔曼科技有限公司提供，甘油、1,4-丁二醇、甲醇均为色谱纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 酶电极法的测试原理

酶电极法的测试原理是甘油通过醋酸纤维素层到达固定化甘油酶膜层，在甘油酶膜的催化作用下发生酶解反应迅速产生H2O2，H2O2通过氧化还原反应产生电流，在一定的浓度范围内，甘油浓度与电流信号呈线性关系，通过电极响应的电压差与甘油浓度之间的线性关系测定甘油浓度。

1.2.2 标准曲线的绘制

用超纯水将甘油标准液（1.0 g/L）稀释配制成6 级甘油标准液，浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L，用M-100 型生物传感分析仪测试甘油标准液的浓度，记录初始电压值和终点电压值，考察甘油标准液浓度测定值和对应电压差之间的线性关系。

1.2.3 测定方法

称取0.6～0.8 g 加热卷烟烟芯材料样品，精确至0.1 mg，置于250 mL 锥形瓶中，精确加入200 mL 萃取溶剂（萃取液中甘油浓度应不超过1.0 g/L），具塞震荡萃取一定时间，静置萃取液10 min 后进行上机测定。M-100 型生物传感器分析仪自动进样、直接读取数据，3 次测量取平均值作为萃取液的甘油浓度，样品中甘油含量以质量分数W 计，数值以%表示，按式（3）进行计算：

式中：W—为样品中甘油含量，单位为%；

c—萃取液中甘油的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；

V——萃取液的体积，单位为毫升（mL）；

m——试样的质量，单位为克（g）；

w0为试样水分的质量分数，%。

结果以两次平行测定结果的平均值表示，精确至0.01%。

1.2.4 气相色谱法对比实验

以1,4-丁二醇为内标，甲醇为溶剂，配制内标浓度为5 mg/mL 的萃取剂。配制6 级甘油标准溶液，浓度分别为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL，对标准溶液进行色谱测定，绘制甘油浓度与峰面积比的标准曲线。对待测样品萃取液进行色谱测定，由回归方程计算得到样品的甘油含量。作为举例，甘油标准样品（4.0 mg/mL）的GC 色谱图见图1(a)，加热卷烟样品（6#）中甘油的GC 色谱图见图1(b)。

色谱柱：HP-INNOWAX 毛细管柱（30 m×0.250 mm, 0.25 μm）；程序升温：初温100 ℃（保持1 min），以15℃/min 速率升至220℃，保持5 min；进样口温度250℃；FID 检测器温度275℃；载气为氦气，流量为1.5 mL/min，恒流模式；空气流量450 mL/min；氢气30 mL/min；尾吹起氦气25 mL/min；进样量1 μL，分流比30:1。

图1 甘油标准溶液和加热卷烟样品中甘油的GC 色谱图Fig. 1 GC chromatogram of glycerol standard solution (a) and HTP samples (b)

1.2.5 加热卷烟抽吸实验

为测定加热卷烟中甘油的转移率，选取5 种加热卷烟进行抽吸实验。采用5 通道直线型吸烟机进行抽吸，抽吸曲线为钟型，抽吸容量为（55±0.3） mL，单口抽吸时间2 s，抽吸间隔10 s，每支卷烟抽吸12口，抽吸完后收集烟芯材料的残渣，按照1.2.3 所示方法进行酶电极法测定甘油含量。甘油转移率按公式（4）进行计算：

式中：R 为甘油的转移率，单位为%；M0为加热卷烟抽吸前甘油含量，单位为mg/支；M1为加热卷烟抽吸后残渣中甘油含量，单位为mg/支。

2 结果与讨论

2.1 萃取剂的选择

烟草及烟草制品中甘油的测定常用的萃取剂有水、甲醇、异丙醇等，高效液相色谱法一般采用水作为萃取剂[8-9]，气相色谱法多采用甲醇作为萃取剂[2-7]，也有一些文献采用异丙醇作为甘油的萃取剂[3]。本实验考察了水、甲醇、异丙醇3 种萃取剂对加热卷烟中甘油的萃取效果（表2），结果表明，同一试样以甲醇作为萃取剂时甘油含量测定结果最高，为16.49%，其次是水，最低的是异丙醇。以甲醇的萃取率作为基准，水的萃取率为甲醇的86%，异丙醇的萃取率只有甲醇的56%，因此选择甲醇作为萃取剂。

表2 不同萃取剂测得的加热卷烟试样甘油含量Tab. 2 Contents of glycerol in HTP cigarettes using different extractants %

2.2 萃取时间的优化

分别以水和甲醇作为萃取剂，考察了不同萃取时间对甘油测定结果的影响。结果表明（表3），随着萃取时间的延长，甘油的测定结果并没有出现显著增加，在萃取时间达到1 h 时甘油萃取率基本达到顶点，无论以水还是甲醇作为萃取剂，在1 h 时甘油测定结果基本趋于稳定，所以选取萃取时间为1 h。

表3 不同萃取时间测得的甘油含量Tab. 3 Contents of glycerol in HTP cigarettes with different extraction time %

2.3 标准曲线、检出限和定量限

以6 级甘油标准液进行酶电极法测定，记录甘油浓度检测值、初始电压值、终点电压值和电压差，结果见表4 所示。以电压差（y）对甘油浓度（x）做线性回归分析，建立酶电极法的标准工作曲线（图2），得到线性方程为y = 531.02x+0.7223，确定系数R2为0.9998，表明酶电极法的甘油标准工作曲线线性良好。将最低浓度的甘油标准液（0.1 mg/mL）重复测定10次，以3 倍和10 倍标准偏差确定方法的检出限和定量限，得到酶电极法甘油的检出限为0.045 mg/mL，定量限为0.149 mg/mL。

表4 不同浓度梯度甘油标准液的检测结果Tab. 4 Test result of glycerol standard solution with different concentration gradient

图2 酶电极法甘油标准曲线Fig. 2 Standard curve of glycerol with enzyme electrode method

2.4 方法的回收率与精密度

选取3 个加热卷烟样品2#、3#、4#，分别以低、中、高3 个梯度水平添加甘油标准品进行方法的加标回收实验。结果表明（表5），3 个样品的加标回收率范围为97.64%～102.32%，可见酶电极法测定甘油的正确度较高，满足样品测试要求。选取1 个加热卷烟样品（5#），进行6 个平行样测定，检测结果的RSD=2.15%(n=6)（表6），表明该方法的重复性较好，精密度较高。

表5 酶电极法的加标回收率试验结果Tab. 5 Spiked recoveries of enzyme electrode method

表6 酶电极法的重复性试验结果Tab. 6 Repeatability test results of enzyme electrode method %

2.5 方法的准确性

为验证方法的准确性，选取有代表性的12 个加热卷烟样品，其中6#～9#为Marlboro HeatSticks 系列，10#～13#为Heets 系列，14#～17#为四川中烟“宽窄”系列，分别采用酶电极法和行业标准方法气相色谱法[5]进行甘油含量测试，采用配对样本t 检验法对检测结果进行统计学检验，并且对两种方法的线性相关性进行分析，结果见表7、表8 和图3 所示。从表7 可以看出，酶电极法与气相色谱法的检测结果一致性较好。从图3 可以看出，两种方法检测结果的线性关系良好，线性方程为y=0.8553x+0.0267，决定系数R2=0.9807。从表8 可以看出，12 个样品两配对样本t 检验的双尾概率P 值为0.202 ＞0.05，95%置信区间的差分下限和上限分别为-0.3363 和-0.0798，说明两种分析方法的检测结果一致，二者之间不存在显著差异。

表7 12 个加热卷烟样品中甘油含量测试结果Tab. 7 Testing results of glycerol content in twelve HTP samples

表8 12 个加热卷烟样品的两配对样本t 检验结果Tab.8 Paired samples T test results of twelve HTP samples

图3 酶电极法与气相色谱法检测结果之间的线性关系Fig. 3 Linear relationship between detection results of enzyme electrode method and gas chromatography

2.6 方法的应用

加热卷烟中的甘油（VG）在加热抽吸过程中会部分转移至烟气气溶胶中，利用酶电极法对加热卷烟抽吸前烟芯材料、抽吸后烟芯材料残渣中的甘油含量进行测定，计算得到甘油的转移率，结果见表9 所示。从表9 中可以看出，18#～20#样品对应的IQOS 加热卷烟Marlboro 和HEETS 系列，其甘油转移率范围为36%～41%，而21#、22#样品对应的“宽窄EVO”系列，其甘油转移率范围为33%～34%。

表9 加热卷烟甘油转移率测定结果Tab. 9 Transfer rates of glycerol of HTP cigarettes

3 结论

建立了一种利用甘油酶电极生物传感器原理快速测定加热卷烟中甘油含量的方法，以甲醇作为萃取剂，振荡萃取1 h，通过酶电极法测得的加热卷烟甘油含量与气相色谱法具有较好的一致性，二者之间呈显著线性相关关系，配对样本t 检验结果显示两种方法测定结果的差异无统计学意义。该方法的回收率、精密度和准确性均较好。与气相色谱法相比，酶电极法具有酶专一性高、稳定性好、检测快速灵敏等特点，适合加热卷烟中甘油含量的快速检测。