细胞外囊泡及其在创伤性颅脑损伤诊疗中应用的研究进展▲

周 娟 秦 喆 李 想 刘 洋

(1 中国人民武装警察部队特色医学中心神经重症医学科，天津市 300162，电子邮箱：921592005@qq.com；2 中国人民解放军联勤保障部队第九八三医院妇产科，天津市 300142；3 中国人民武装警察部队海南省总队儋州支队机动大队卫生所，海南省五指山市 572200；4 上海市闵行区中心医院神经内科，上海市 201100)

【提要】 细胞外囊泡是膜状纳米颗粒，其被分成外泌体和微囊泡。两种类型的细胞外囊泡均可由多种细胞产生并分泌到细胞外环境中。细胞外囊泡将核酸、蛋白质、脂质等多种来源于母细胞的信息物质包裹其中或携带在其膜上，它们可参与细胞间信号传递、蛋白质和RNA的递送等。在外周血样品中可收集到富含源于神经元的细胞外囊泡，定量检测其内容物可动态评估创伤性颅脑损伤(TBI)后机体的潜在变化。此外，细胞外囊泡可以加强组织再生、参与免疫调节，并可作为干细胞治疗的潜在替代品。本文主要针对细胞外囊泡及其在TBI诊疗中应用的研究进展进行综述。

细胞外囊泡包含高度保守和快速的细胞间通信系统，细胞可以通过该系统及脂质、蛋白质或核酸等物质进行信息交流。Wolf[1]首次发现细胞外囊泡参与骨矿化和具有血小板功能，并称其为“血小板粉尘”。20世纪80年代早期，细胞外囊泡的亚型外泌体即被发现，其可帮助排除细胞不需要的分子，例如网织红细胞在向红细胞成熟的过程中通过外泌体排出转铁蛋白受体[2]。后续的研究表明，细胞外囊泡在免疫系统中具有高度调节性，且可参与细胞间信号通信、蛋白质和RNA的递送等[3]。最近5年，已有研究阐明细胞外囊泡调节生物功能的各种机制，包括组织稳态、炎症调节、肿瘤的生长和转移等。细胞外囊泡具有极其广泛的生物学功能以及在细胞间穿梭的能力，这为开发新的诊疗方法提供了独特的平台。

当前，评估创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)的主要手段是神经影像学检查，但其尚不能确定脑损伤的真实程度，也无法提供继发性细胞死亡、血脑屏障破坏、神经炎症和兴奋毒性等信息。研究者可以从外周血样品中收集富含源于神经元的细胞外囊泡，定量检测其内容物，并以此动态评估发生TBI后的潜在变化，辅助临床医师做出适当决策；亦可通过细胞外囊泡运输或递送具有特殊作用的蛋白质、药物、生物制剂等至靶细胞，或可促进特定功能的修复。本文介绍细胞外囊泡的产生、分子组成及其内容物作为TBI诊疗潜在生物标志物的研究进展，以期帮助临床医生更好地理解和治疗TBI。

1 细胞外囊泡概况

1.1 细胞外囊泡的结构及特点 细胞外囊泡几乎存在于所有生物流体中，包括羊水、血液、尿液、唾液、母乳、脑脊液和腹液等。细胞外囊泡分为外泌体和微泡，前者源于内体/多泡体系统，是直径为30～150 nm的较小细胞外囊泡；后者通过质膜出芽方式从母细胞膜表面脱落产生直径为100～300 nm的较大细胞外囊泡。两种类型的细胞外囊泡均由淋巴细胞、肥大细胞、血小板、内皮细胞、神经元和树突细胞等多种细胞分泌[6]。20世纪90年代，学者对细胞外囊泡结构有重大发现，即外泌体含有的转铁蛋白受体可允许它们与其他膜蛋白分离并得到纯化，这一发现揭示了外泌体在细胞间信号转导中的重要作用。

细胞外囊泡是由脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡，内含多种类型蛋白质和脂质，包括92 897种蛋白质，27 642种mRNA，4 934种微小RNA和584种脂质[7]。细胞外囊泡内含的蛋白质和脂质特征进一步揭示了细胞外囊泡的功能作用。其中，四跨膜蛋白、膜转运和融合蛋白、热休克蛋白是迄今为止研究较为广泛的蛋白质[5]。Rab家族、膜联蛋白和热休克蛋白在细胞外囊泡的装配和运输中起关键作用；四跨膜蛋白在细胞迁移、融合、细胞-细胞黏附和信号传导方面起重要作用；外泌体中大量存在的整合素可调节细胞外囊泡与其靶细胞的黏附[8]；此外，磷脂酰丝氨酸参与细胞外囊泡和质膜的信号传导和融合，并通过不同的磷脂运输酶来耦合细胞外囊泡膜上表达的蛋白质,而单唾液酸四己糖神经节苷脂和鞘磷脂有利于细胞外囊泡硬度的形成[9-10]。

1.2 细胞外囊泡的生物功能 细胞外囊泡由细胞分泌，并通过血液、脑脊液、尿液、羊水等生物流体转运，其在细胞间通信和启动生理反应过程中起关键作用。细胞外囊泡表面存在主要组织相容性复合体Ⅰ类和Ⅱ类分子，它们由抗原呈递细胞分泌，并通过激活CD8+T细胞和CD4+T细胞触发特异性免疫应答[11]。细胞外囊泡还携带可能被转移到受体细胞的脂质、蛋白质、核酸(DNA、信使RNA、环状RNA、微小RNA、长链非编码RNA等)等多种母细胞来源的生物活性成分。例如，胶质母细胞瘤源性细胞外囊泡包含的mRNA和微小RNA具有触发血管生成的潜力[12]。

细胞外囊泡参与并影响众多的生物过程，包括清除细胞废物和参与炎症免疫反应、红细胞成熟、凝血、血管生成、细胞存活与凋亡、自噬等[13-14]。细胞外囊泡通过特异性靶向锚定的方式在细胞间信号传导方面发挥关键作用，并通过转移信使RNA和K-Ras蛋白发挥促进血栓形成、肿瘤增殖和血管生成的作用。细胞外囊泡除了具有潜在的益处和生理作用外，还可能参与机体内疾病的传播。例如，运输错误折叠蛋白的细胞外囊泡在帕金森病的发病中具有重要作用[15]，在心血管疾病和AIDS等传染病的传播中亦有潜在作用[7]。因此，特定类型的细胞外囊泡有望成为辅助疾病诊断及预后判断的新分子标记物，并为细胞治疗途径开辟新思路。

1.3 细胞外囊泡的分离 从生物样品中分离细胞外囊泡的常用方法有以下几种：(1)离心。利用基于差异或密度梯度的离心法。(2)基于分子大小的色谱-过滤法。根据样品中存在的不同生物分子的大小差异来分离细胞外囊泡。(3)基于蛋白相互作用的聚合物沉淀法。利用细胞外囊泡和聚合物之间的蛋白质-蛋白质相互作用来实现细胞外囊泡分离。(4)基于抗原-抗体的免疫沉淀法。根据细胞外囊泡表面标志物蛋白质的免疫性进行分离，可对所有细胞外囊泡、甚至不同细胞类型特异性表面物质进行选择[16-18]。

2 神经系统的细胞外囊泡

2.1 脑组织内细胞外囊泡的组装和释放 细胞外囊泡在次级内体或多泡体中通过质膜内吞作用产生，并进行细胞蛋白和RNA物质的相关募集和内化。细胞外囊泡内的蛋白质和RNA可反映正在进行的细胞活动，为评估细胞事件提供了一个窗口[5，19]。细胞外囊泡由细胞释放后在间质液内行进到邻近的细胞或者通过循环到达远处的目标，起到直接或间接的调节作用。已有学者在动物模型以及人类的血浆或血清样品中发现并且成功分离出细胞外囊泡[20]。利用抗原-抗体免疫沉淀技术可从不同类型中枢神经系统细胞中分离出细胞外囊泡亚型。通过定量评估不同亚型细胞外囊泡中的蛋白质和RNA含量，可评估神经功能、疾病状态和治疗条件的变化[21]。

2.2 细胞外囊泡与神经系统疾病的关系 星形胶质细胞、神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞等中枢神经系统细胞均可分泌细胞外囊泡，其参与再生、突触功能的调节和神经元发育等重要生理过程[22]。类似于其他系统，中枢神经系统中的细胞外囊泡也是细胞间通信、免疫反应调节、细胞废物清除、与神经细胞之间信号传导等生理反应的关键参与者[22-23]。最近的研究表明，细胞外囊泡可能参与促进神经胶质和神经元之间的信号传导[24]。例如，来自人体脑脊液或源自小鼠来源神经瘤母细胞的细胞外囊泡可以减轻由Aβ(阿尔茨海默病患者体内合成或脑组织产生)引起的突触可塑性破坏程度[25]；而小胶质细胞分泌的细胞外囊泡可以促进tau蛋白的扩散，而抑制细胞外囊泡合成似乎可以减少这种tau蛋白传递[23]。

由于细胞外囊泡可穿过血脑屏障，可从全身血循环系统、唾液、尿液等中实时收集并提取，然后量化其内含物，故其或可成为具有重要价值的诊断工具。有学者发现，细胞外囊泡可用作为诊断帕金森病、多发性硬化症、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化症和阿尔茨海默病等神经退行性疾病的生物标志物，而这些疾病与蛋白质错误折叠有关，故可通过发现并量化源自中枢神经系统的细胞外囊泡来评估此类疾病[26]。

3 细胞外囊泡在TBI诊疗中的应用价值

70%～90%的TBI患者可继续发展为长期的或永久性的神经认知功能障碍[7]。目前，TBI患者后期发展为阿尔茨海默病或帕金森病等神经退行性疾病的易感性尚未明确。因此，我们需要更加易于获取的生物标志物，用于鉴定潜在的病理生理变化，以辅助TBI的早期诊断和优化治疗。

3.1 细胞外囊泡在TBI评估中的潜在作用 虽然有关急性期和更严重类型TBI的血液和脑脊液生物标志物的鉴定和表征研究取得了进展，但对于不同形式TBI在数小时、数天、数周和数月内发生的动态变化，目前仍尚未能阐明。阐释这些动态变化有助于了解急性TBI后的病理学变化，进而定义治疗性干预的最佳时间窗，并探寻最适合此窗口期的用药方案及区分反应最佳的个体[27]。就此而言，血浆中的神经元和星形胶质细胞源性细胞外囊泡或有望用于鉴定中枢神经系统的病理生理学状态。最新的研究表明，细胞外囊泡蛋白谱含有损伤特异性生物标志物[28]，其中TBI患者的神经元源性细胞外囊泡中磷酸化tau蛋白水平升高[29]。目前，已可通过检测星形胶质细胞和(或)小胶质细胞产生的细胞外囊泡来评估神经炎性反应[30]。因此，通过动态收集和评估受生理及环境变化、疾病状态影响的细胞源性细胞外囊泡，可更加准确地判断TBI患者的状态。

经典TBI生物标志物通常被用于单个时间点的病情评估，且不同研究所得的结论也不尽相同，因此其只能提供头部损伤后事件的即时情况。当前，可根据细胞外囊泡表面的中枢神经系统特异性细胞标记物，相对快速地分离富集血浆中中枢神经系统源性的细胞外囊泡，例如利用神经黏附蛋白——神经细胞黏附分子和L1细胞黏附分子(CD171)分离富集神经元细胞外囊泡，利用谷氨酰胺天冬氨酸转运蛋白分离富集星形胶质细胞，并通过免疫沉淀收集细胞外囊泡。目前的技术可以在单个样品中重复量化多蛋白和(或)从TBI伤后生化级联反应中提取RNA，这使我们能够更加深入地动态探析TBI伤后疾病进展机制、宿主对TBI的稳态反应以及治疗方案疗效。将经典的标志物与细胞外囊泡结合进行动态评估，并通过细胞、动物实验和探索性临床试验验证，有望为TBI和其他神经变性疾病提供真正有用的生物标志物。但这些细胞外囊泡与经典的血浆和(或)脑脊液源性TBI标记物之间的具体关系，尚有待进一步阐明。

3.2 细胞外囊泡在TBI干预中的潜在作用 细胞外囊泡可释放RNA和蛋白到其母细胞周围的局部微环境或经体循环远程传递至靶细胞(器官)，从而为细胞间信号的传导提供有效机制[31]。细胞外囊泡可通过受体-配体作用、抗原呈递等多种方式与受体细胞相互作用或结合。此外，细胞外囊泡可附着并融合入其靶细胞或通过内吞作用内化。无论何种交互机制，现已证实细胞外囊泡的内容物可在被转移后的新位置处起作用。例如，大鼠细胞外囊泡中的信使RNA可被提取并成功移植入人体细胞内[32]；含有小干扰RNA的细胞外囊泡被注入小鼠后可将小干扰RNA传递至靶组织[33]。因此，通过细胞外囊泡运输或递送具有特殊作用的蛋白质、药物、生物制剂等至靶细胞，或可促进特定功能的修复。Kim等[34]研究发现，浆细胞瘤源性细胞外囊泡可成功降低关节炎患者机体的炎性和自我免疫反应。近期有关TBI动物模型的研究结果显示，间充质干细胞源性细胞外囊泡可促进神经功能恢复，减轻模式分离和空间学习障碍，促进神经及血管生成，降低神经炎症反应[35]。

4 小 结

目前，细胞外囊泡因其所有的功能已成为神经科学领域的研究热点之一。通过动态收集和评估受生理、环境变化、疾病状态影响的细胞源性细胞外囊泡可更加准确地判断TBI患者状态，或通过细胞外囊泡帮助运输或递送具有特殊作用的蛋白质、药物、生物制剂等至靶细胞可促进特定功能修复。细胞外囊泡在TBI诊疗领域的应用处于起步阶段，仍有许多难题需要攻克，但正在进行的细胞外囊泡生产优化和细胞外囊泡内容物、生物学功能剖析的研究，有望使细胞外囊泡成为高效多功能的诊疗平台。