酶消化法分离和培养人源原代跟腱干细胞*

郭东昇 佘远时 李慧 解敏 虞宵 储文亚 张向鑫 陈广祥 王东来*

跟腱断裂好发于运动活跃的中青年患者，是常见的骨科及运动医学疾病。跟腱损伤后，依靠自然愈合只能形成排列错乱的胶原纤维和细胞外基质，无法恢复正常的生物力学功能[1]。同时，修复后的跟腱仍有较高的再断裂发生率[2]。理想的治疗手段既要增强跟腱组织的再生能力，同时也要促进跟腱的愈合进程，减少跟腱粘连的发生。近年来，以细胞为基础的组织工程在医疗领域飞速发展，目前已知很多种类细胞均可作为跟腱修复的潜在细胞来源，如成纤维细胞[3]、间充质干细胞[4-5]、腱细胞[6]和脂肪来源干细胞[7]。然而到目前为止，国内外仍没有研究者对人胎儿跟腱干细胞进行分离、培养和鉴定。亦没有研究者对胎儿来源跟腱干细胞的蛋白表达进行探索。本研究旨在探索分离培养人胎儿跟腱干细胞的有效办法，并对跟腱干细胞的生物学特性进行研究，从而为临床治疗跟腱损伤提供更优选择。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 组织及细胞来源

本研究所使用的胎儿组织均严格按照伦理学要求进行，流产胎儿来源为患有严重心脏畸形无法治愈而选择流产者。患者家属均签署知情同意书，且得到了本院伦理委员会的批准（伦理审查号：K-2019-006-H01）。本实验所使用的阳性对照细胞：人骨髓间充质干细胞（human bone mesenchymal stem cells，hBMSCs）为本中心实验室惠赠。

1.1.2 实验试剂及耗材

细胞培养瓶/细胞培养板（Corning 公司，美国），胎牛血清（Gibco 公司，美国），I 型胶原酶（Sigma 公司，美国），中性蛋白酶（Roche 公司，美国），兔抗人CollagenⅠ抗体（Proteintech 公司，中国），兔抗人Collagen Ⅱ抗体（Proteintech公司，中国），兔抗人Collagen Ⅲ抗体（Proteintech公司，中国），兔抗人Tensacin-c 抗体（abcam 公司，美国），兔抗人SCXA 抗体（abgent 公司，中国），兔抗人GAPDH抗体（Proteintech 公司，中国），人骨髓间充质干细胞成软骨/成骨/成脂肪诱导分化完全培养基（广州赛业生物科技有限公司），反转录试剂盒（Thermo Fisher 公司，美国），qPCR试剂盒（Thermo Fisher 公司，美国），FITC anti-human CD34/CD44/CD45/CD90 抗体（BioLegend 公司，美国）。

1.1.3 实验仪器

细胞培养箱（Thermo Fisher 公司，美国），超净工作台（艺思高科技公司，新加坡），流式细胞仪（Beckman 公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 人胎儿来源跟腱干细胞的分离、培养

取孕20 周流产新鲜胎儿，在无菌条件下取出双侧跟腱组织，仔细剔除跟腱腱鞘、腱周膜组织。无菌PBS 冲洗跟腱组织3 次，将跟腱组织置于0.25%浓度的胰蛋白酶中室温下预消化10 min。将预消化后的肌腱组织剪成1 mm3大小，加入组织消化液，消化液成分为3 mg/mL 的Ⅰ型胶原酶和4 mg/mL 的中性蛋白酶。置于培养箱内消化30 min。消化后用70 m 细胞筛过滤，PBS 清洗细胞2 次。以稍低密度接种于细胞培养瓶中。培养液成分为10%胎牛血清+100 U/mL 青链霉素+90%低糖DMEM培养基。培养条件为:37℃、5%CO2。

1.2.2 CCK-8 法检测人源跟腱干细胞的增殖能力

分别取P1、P2、P3 代细胞消化后重悬，调整细胞浓度至2×104个/mL。96 孔板每孔加100 L 细胞悬液（每孔含2 000 个细胞），每组设置6 个复孔，37℃、5%二氧化碳浓度条件下培养。分别于细胞培养第1、3、5、7 d，每孔加入10 L CCK-8 溶液，放回培养箱孵育1 h。用酶标仪分别测定450 nm 吸光度，记录并绘制增殖曲线。

1.2.3 流式细胞术检测人源跟腱干细胞表面标志物

取P3 代细胞，消化后离心，用预冷的PBS 制备成细胞悬液，将细胞浓度调整至5×105cells/cm2密度，按量加入抗体（CD34、CD44、CD45、CD90），避光在饱和湿度下孵育30 min，完成后，每管细胞加入2 mL PBS 清洗，1 000 rpm离心5 min 后去掉上清，加入0.3 mL PBS 重悬，上机检测。流式细胞仪每个样品检测10 000 个门内细胞。

1.2.4 人源跟腱干细胞及人骨髓间充质干细胞多向分化潜能的鉴定

成骨诱导分化：取P3 代2 种细胞，按前述方案培养，待细胞融合至65%时，换用成骨诱导分化培养基，每3 d 换液1 次。连续诱导21 d 后，将细胞固定后用茜素红进行细胞染色；成脂诱导分化：取P3 代2 种细胞，按前述方案培养，待细胞融合至100%或者过度融合后，换用成脂诱导分化培养基A 液。诱导3 d 后换用成脂诱导分化培养基B 液，24 h 后，换回A 液继续进行诱导。交换作用5 次后，用B液维持培养7 d，将细胞固定后用油红O 染色；成软骨诱导分化：取P3 代2 种细胞约3×105个细胞离心后用软骨诱导分化完全培养基重悬，再次离心得到细胞微球，直接将细胞微球置于0.5 mL 软骨诱导分化完全培养基中培养，持续诱导21 d 后，对软骨球进行福尔马林固定和石蜡包埋切片，进行番红O 染色;RT-qPCR 检测成软骨分化相关基因:ACAN;成骨分化相关基因: OSX; 成脂分化相关基因: PPARG 的表达，选取诱导分化后的细胞，用Trizol 法提取细胞RNA。RNA 反转录得到cDNA，以cDNA 为模板，进行实时荧光定量PCR 检测。对照组为无诱导分化能力的完全培养基培养的细胞。引物由上海捷瑞生物科技公司负责合成（引物序列见表1）。

表1 引物名称、引物序列及产物大小

1.2.5 细胞免疫荧光检测人源跟腱干细胞Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、Collagen Ⅲ、Tenascin-C、Scleraxis 的表达

取P3 代细胞，消化后接种于24 孔板，待细胞融合达到50%时，吸弃完全培养基，PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透20 min。一抗4℃孵育过夜，PBS 清洗3 次，加入荧光标记的二抗37℃孵育1 h，PBS 清洗后进行DAPI 染核，用激光共聚焦显微镜观察并采集照片。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件对数据进行分析。所有计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析和成组 检验进行分析；计数资料用率表示，采用卡方检验进行组间比较。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态、增殖能力的观察

P0 代细胞在37℃、5%CO2条件下培养第5 天，细胞融合率达到约70%，细胞形态呈多边形或星型（见图1A），继续培养至细胞融合率更高时，细胞呈现特征性的“鹅卵石样”排列（见图1B）。继续传代至P3 代，细胞呈扁平状或成纤维细胞状（见图1C）。

CCK-8 法测定细胞增殖实验证实: 同一代的hTDSCs 的OD 值随培养时间的延长而升高，培养1、3、5、7 d 时，P1、P2、P3 代细胞增殖差异无统计学意义（＞0.05），如图2 所示。

图2 CCK-8 检测P1、P2、P3 代TDSC 细胞增殖能力差异

2.2 细胞表面标志物的鉴定

本实验采用流式细胞术来分析hTDSCs细胞的表面标志物。结果 显示：CD34 (-) CD44 (+) CD45 (-) CD90 (+)。CD34 (-) CD45 (-)，排除了造血细胞和上皮细胞污染的可能性，干细胞表面标志物CD44、CD90 均为强阳性，CD44阳性率为95.79%，CD90 阳性率为99.61%。初步证明分离细胞是具有干性的，如图3 所示。

2.3 细胞多向分化潜能的鉴定

成骨诱导分化：P3 代hTDSCs/hBMSCs 在成骨诱导分化培养基中诱导21 d 后，用茜素红进行染色。两种细胞均呈层叠样生长，并且出现明显的聚集，局部出现钙盐沉积，形成钙结节，茜红素染色出现红色钙结节，证明hTDSCs 与hBMSCs 一样，具有成骨分化能力（见图4D）。RT-qPCR 结果显示hTDSCs 表达成骨分化相关基因：OSX 的表达较空白对照组明显增加（见图4G）。

成脂诱导分化：P3 代hTDSCs 通过成脂肪诱导分化28 d后，细胞胞质中出现脂肪滴，并逐渐增大、融合。油红O 染色后可见细胞内大小不等的橘红色脂滴（见图4E）。P3 代hTDSCs 分化结果的阳性染色区域与hBMSCs 基本一致。PPARG 的表达较对照组升高约4 倍（见图4H），证明hTDSCs有明显成脂分化能力。

成软骨诱导分化:两种细胞微球在软骨诱导分化培养基中立体培养21 d 后，细胞微球福尔马林固定、石蜡切片、番红O 染色后光镜下观察，细胞微团被染成红色，证明有软骨生成（见图4F）。成软骨相关基因ACNA 的表达水平也明显升高（见图4I），证明hTDSCs 有明显成软骨分化能力。

2.4 细胞表达Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、Collagen Ⅲ、Tenascin-C、Scleraxis 的研究

细胞免疫荧光显示，hTDSCs 表达Collagen Ⅰ（见图5A）、Collagen Ⅲ（见图5C）、Scleraxis（见图5D）、Tenascin-C（见图5E），不表达Collagen Ⅱ（见图5B）。

图3 流式细胞术检测细胞表面标志物，从左到右分别为CD34、CD44、CD45、CD90，其中CD44、CD90 为强阳性。CD34、CD45 为阴性，下排为同型对照，均为阴性

图4 A-C.分别为P3 代人骨髓间充质干细胞成骨、成脂肪、成软骨分化结果（×200）; D-F.分别为P3 代跟腱干细胞成骨、成脂肪、成软骨分化结果（×200）;G-I.为RT-qPCR 检测成骨分化相关基因（OSX）、成脂分化相关基因（PPARG）、成软骨分化相关基因（ACAN）在空白对照组和分化组的表达水平。*表示≤0.05;***表示≤0.001

图5 共聚焦显微镜拍摄细胞免疫荧光结果（×400）

3 讨论

跟腱是一种致密、规则的结缔组织，主要由Ⅰ型胶原组成。胶原纤维平行排列，组成被腱内膜包裹的跟腱束，跟腱束致密地平行排列，形成跟腱[8]。跟腱损伤是运动员的常见疾病之一，由于肌腱的再生能力比较差，跟腱断裂后常常由错乱排列的瘢痕组织修复，其生物力学强度很难再满足剧烈运动的要求。近些年，组织工程技术的迅猛发展，为跟腱损伤的治疗提供了新的思路。干细胞治疗跟腱损伤具有非常广阔的应用前景。2007 年，Bi 等[9]从小鼠和成人的跟腱组织中分离出干细胞，并且将其命名为跟腱干细胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）。Yang 等[1]在2016 年对胎牛的跟腱细胞进行处理，分离出牛跟腱干细胞，为跟腱干细胞治疗肌腱损伤提供理论支持和实验室依据。跟腱干细胞可以自然地朝跟腱细胞分化[10]，因此跟腱干细胞在治疗跟腱损伤上具有无可比拟的优势。

跟腱干细胞能够广泛应用于临床的基础之一就是能够更高效地分离、培养这种细胞，因此探索一种高效的分离办法迫在眉睫。本实验采用先用胰蛋白酶预消化，然后用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶混合消化的分次消化办法成功分离出大量跟腱干细胞。本实验分离的细胞从形态学、细胞表面标志物、多向分化潜能3 个方面鉴定了其干细胞特性。跟腱干细胞表面标志物CD34-、CD44+、CD45-、CD90+，这其中CD34-、CD45-排除了细胞干性来源于血液干细胞的可能性，这与目前已有的大鼠和牛来源的跟腱干细胞研究是吻合的[1,11-13]。跟腱干细胞具有朝骨、软骨、脂肪分化的潜能，这可以解释一些肌腱疾病的病因。目前有学者认为，跟腱干细胞在病理状态下的异常分化可能是肌腱慢性疾病的发病原因[14]，而目前常见的肌腱损害的主要病理特征为钙质沉积、脂肪变性[15]，这与跟腱干细胞在病理状态下生长分化的结果是一致的。通过细胞免疫荧光发现：人源跟腱干细胞表达Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白，不表达Ⅱ型胶原蛋白，这与跟腱组织中的主要胶原蛋白类型是吻合的[16]。通过免疫组化可知，跟腱组织中，约95%为Ⅰ型胶原纤维，约5%为Ⅲ型胶原纤维。Ⅰ型胶原纤维是成熟的胶原类型，而Ⅲ型胶原纤维主要起修复作用，在跟腱损伤的早期，Ⅲ型胶原表达量上调。在跟腱损伤疤痕愈合后，这两种胶原表达量均明显下降[17]。这提示我们：跟腱干细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白，很有可能是跟腱干细胞促进跟腱损伤愈合的机制之一。同时，人源跟腱干细胞表达Tenascin-C、Scleraxis 蛋白。Tenascin-C 是一种黏附调节蛋白，它在发育、分化或伤口愈合期间调节细胞的增殖和分化[18]。说明跟腱干细胞在跟腱损伤时，能够调节自身增殖分化为跟腱细胞，从而加速损伤的愈合。有研究表明，Scleraxis 可将其他来源干细胞分化为肌腱细胞[19]，这说明Scleraxis 在调节祖细胞分化为肌腱组织及肌肉附着物中起重要作用[20]。肌腱干细胞表达这些蛋白，都说明其在跟腱组织的发育分化以及损伤修复中起重要作用。然而，跟腱干细胞在体内的确切作用机制还不清楚，它可能通过直接分化为终末细胞或分泌有利于肌腱修复的营养因子来维持肌腱的稳态和加速肌腱的修复[21-22]。如果能研究清楚其确切作用机制，那么在未来的细胞药物或生物材料领域可能会起到一定作用。目前已有研究者将其作为种子细胞应用于动物跟腱损伤模型的研究[23]。近年来，国内外有大量文献研究复合支架材料搭载干细胞用于治疗[24-25]。并且取得了比单纯搭载支架或单纯细胞移植更好的预后。这说明，人源跟腱干细胞也可能是一种可以搭载在生物材料上的种子细胞，通过其释放的细胞外基质，起到加速损伤愈合，从而使损伤的肌腱获得更接近生理状态下的肌纤维结构及生物力学特性。

综上所述，酶消化法是分离、培养跟腱干细胞的有效办法，跟腱干细胞表达与跟腱损伤修复密切相关的蛋白。本实验为跟腱干细胞细胞系的建立及临床应用提供依据。