表观遗传机制与肝纤维化研究进展▲

申秋艳 罗伟生

(1 广西中医药大学第一临床医学院，南宁市 530023，电子邮箱：923059147@qq.com；2 广西中医药大学附属瑞康医院，南宁市 530011)

【提要】 肝纤维化是一种受多种理化生物因素影响的复杂性肝内纤维结缔组织异常增生的病理过程。多种表观遗传机制，如DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA基因调控等在肝纤维化的发生发展中扮演着重要角色。本文综述了表观遗传机制在肝纤维化中的表达情况及其意义，为肝纤维化的早期诊断及临床治疗提供新的思路。

肝纤维化是指在各种理化因素、局部缺血、感染、免疫反应等损伤因子作用下，肝脏中以胶原蛋白为主的各种细胞外基质(extracellular matrix，ECM)代谢失衡，导致ECM过度沉积，肝脏结构被破坏，肝内纤维结缔组织异常增生的病理过程。其中，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化为肌成纤维细胞是ECM的主要来源。因此，HSC活化被认为是肝纤维化过程的中心环节，而上述病理过程均受基因调控，包括多种表观遗传机制。表观遗传是指在无DNA序列改变的情况下，通过调控特异基因的表达，影响组织细胞表型，发挥对细胞分化、胚胎发育生长、机体功能运行的调控作用，在肝纤维化的发生发展过程中起着举足轻重的作用[1]。

1 表观遗传机制概述

表观遗传学最先于1942 年由Waddington[2]以“后成论”和“遗传学”的合成词提出。此后多次重提，直到2008年的冷泉港会议，各专家对该概念达成了共识，即“表观遗传学是指基因表达的稳定和可遗传的变化，而非DNA序列改变”[3]。在同种生物体的所有细胞中，除生殖细胞外，其他细胞的基因组及DNA序列都是相同的。但是，不同的细胞类型有其特异的表观基因组控制细胞表型，使不同组织细胞有自己定义的不同于其他组织细胞的表观遗传学特征，调控着生命活动向不同方向运行。表观遗传机制包括DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白修饰、印记基因丢失、非编码 RNA(non-coding RNA，ncRNA)基因调控等，其中DNA甲基化、组蛋白修饰和ncRNA基因调控是目前研究较多的机制。

2 DNA甲基化与肝纤维化

DNA甲基化发生在胞嘧啶核苷酸中嘧啶环的第5个碳上，最常见于胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)双核苷酸中。DNA 复制时，S-腺苷甲硫氨酸上的甲基被DNA甲基化转移酶脱下，并与CpG 双核苷酸 5′端的胞嘧啶发生共价结合，形成 5′甲基胞嘧啶，且这是一个可逆的过程。范钰琨等[4]以DNA序列最小长度为200bp，GC占比不小于50%，CpG观察预期不小于1.4的标准寻找CpG岛，结果显示CpG岛具有非常重要的作用。60%以上基因的启动子和第一外显子区域含有大量的CpG岛，可以与转录因子高度结合，高甲基化状态会降低其与转录因子的结合，从而影响下游基因的转录表达。因此，学者们认为DNA甲基化与基因沉默有关，而研究基因转录区CpG岛的甲基化状态对认识疾病十分重要。

DNA甲基化分析和基因定位研究表明，在人体器官纤维化的进程中，DNA甲基化发生了显著的变化[3]。有报告显示，与器官纤维化进程相关的已知基因，如Thy1、Fli1和Rasal1基因的DNA低甲基化状态均与成纤维细胞和胶原蛋白的生成相关[5-6]。Zeybel等[7]使用Illumina Infinium珠阵列对29名轻度和重度肝纤维化患者进行全基因组甲基化分析，获得了310个差异甲基化区域，并发现同源异型盒A2基因和组蛋白脱乙酰基酶4的高甲基化状态以及蛋白磷酸酶1调节因子亚基18的低甲基化状态与重度肝纤维化显著相关。Agata等[8]发现DNA甲基化和DNA羟甲基化伴随着HSC调节酶活性的变化和肝纤维化发展的整个进程。

此外，DNA甲基化可以通过靶向调控肝纤维化相关基因的表达，影响HSC的活化，参与肝纤维化的发生发展。Chen等[9]发现在四氯化碳诱导小鼠肝纤维化过程中，CpG位点的Sad1/UNC84结构域蛋白-2(Sad1/UNC84 domain protein-2，SUN2)基因呈高甲基化状态，SUN2基因表达降低，HSC活化；该研究的体外实验还发现，用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷处理活化的HSC-T6细胞后，SUN2基因的高甲基化状态发生逆转，SUN2表达增强，促进肝纤维化的相关因子被抑制，肝纤维化程度减轻。Moran-Salvador等[10]报告5 -氮杂胞苷和Zeste同系物增强因子2抑制剂(组蛋白甲基转移酶抑制剂)在体外和体内均可抑制HSC 的活化。此外，DNA甲基化还可以调控肝脏炎症反应。如炎症反应的关键趋化因子分泌型磷酸蛋白1基因在肝纤维化早期呈低甲基化状态[11]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的高甲基化状态可抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达，增强巨噬细胞活性及诱导多种促炎因子生成，放大炎症效应[12]。

3 组蛋白修饰与肝纤维化

H2A、H2B、H3和H4各2个分子共同组成组蛋白8聚体。组蛋白8聚体分子和盘绕在其分子表面的DNA双螺旋共同组成染色质的基本单位-核小体。在两个相邻核小体之间的DNA连接线上，结合着第5种组蛋白。这些球状组蛋白具有N端长尾，翻译后可进行修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、苏酰化、泛素化或二磷酸腺苷核糖基化，这些化学基团为特定蛋白复合物提供了结合位点，这些特定蛋白复合物可以激活或沉默基因，从而影响细胞的生物学功能。在肝纤维化的研究中，组蛋白的甲基化和乙酰化是目前研究较多的机制。

3.1 组蛋白的甲基化 肝纤维化主要受组蛋白H3和H4残基的调控，Fei等[13]以人HSC细胞系LX-2为细胞模型进行研究，发现抑制组蛋白甲基化修饰可抑制低氧诱导因子1核转运、自噬体形成以及LX-2细胞活化，提示组蛋白甲基化修饰在调节HSC活化的低氧诱导因子1信号级联中发挥着重要作用。Pollicino 等[14]报告，组蛋白H3与H4的甲基化状态对HBV的复制具有重要作用。Martin-Mateos等[15]的研究证实组蛋白甲基转移酶参与转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)信号通路，影响HSC活化。

3.2 组蛋白的乙酰化 组蛋白乙酰化可以促进转录，而组蛋白去乙酰化则抑制转录。Dou等[16]发现，肝硬化的形成过程中，激活HSC分化为肌成纤维细胞，需要p300(一种调节转录的组蛋白乙酰转移酶)的核积累。Park等[17]报告N-羟基-7-(2-萘硫)heptanomide(一种新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂)可以抑制胆管结扎引起的肝纤维化大鼠体内HSC的活化，减少肝ECM的积累，抑制肝纤维化进展，保护肝脏功能。此外，Valerio等[18]还发现组蛋白MaroH2A1.1表达上调能够改善葡萄糖代谢，抑制脂质生成基因的表达，降低脂肪酸的含量，间接发挥护肝作用。

组蛋白修饰调控肝纤维化的过程中常伴有DNA甲基化的参与，两者共同影响肝纤维化的进程。Taghdouini等[19]发现，肝细胞类型的特异性DNA甲基化影响细胞早期发育和分化相关功能，DNA甲基化与人类HSC激活相关的转录存在部分一致性，此外，在参与肝纤维化的基因的启动子和推定的新型增强子元件中，组蛋白的甲基化和乙酰化变化步调一致。

4 ncRNA基因调控与肝纤维化

除了DNA甲基化和组蛋白修饰，ncRNA也可以调控细胞表型。ncRNA是一种功能性非蛋白编码的RNA分子，根据其分子大小和在转录过程中的功能可分为长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)、小核RNA、核仁小分子RNA、小干扰RNA等。ncRNA广泛参与染色质修饰、基因转录等过程，还参与基因表达的表观遗传学调控。其中，肝纤维化与miRNA、lncRNA的相关研究最多。

4.1 miRNA miRNA被认为是HSC活化的关键调控因子。研究发现，miRNA-212超表达可以通过激活TGF-β信号通路，诱导HSC活化，生成α平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白[20]。高表达水平的miRNA-214通过抑制Hedgehog通路的负调节因子Sufu表达，促进HSC活化[21]。miRNA-145可通过靶向调节核转录因子锌指E-框结合蛋白2，影响Wnt/β-catenin通路，参与肝纤维化过程[22]。至少有一部分lncRNA-p21通过miRNA-17-5p介导的Wnt/β-catenin途径抑制HSC活化[23]。在肝脏炎症和纤维化的发展过程中，miRNA-378在核因子κB-肿瘤坏死因子α轴的调节中起关键作用，被认为是治疗非酒精性脂肪性肝病的潜在靶点[24]。在半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-8和线粒体介导的凋亡信号传导途径的参与下，miRNA-21可通过靶向FasL调节瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡[25]。高表达水平的miRNA-182和低表达水平的叉头框蛋白O1通过反馈磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路，促进肝纤维化细胞的增殖并抑制其凋亡，促进肝纤维化的发展[26]。miRNA-29a可通过抑制Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)2和TLR4信号通路进而抑制肝纤维化形成[27]。还有研究发现，miRNA-25可充当负反馈抗纤维化控件，调节Notch、Wnt和TGF-β信号传导之间的交联，同时影响多条信号通路，调控肝纤维化过程[28]。

总之，miRNA可通过负调控 TGF-β/Smads、Wnt、Hedgehog、核因子κB、Caspase、PI3K/AKT、TLR等信号通路，介导 HSC 的活化、增殖和凋亡，影响ECM代谢和上皮-间质转化，参与肝纤维化的调控。此外，miRNA还可通过调控细胞因子的表达，参与肝纤维化。李贻弘等[29]发现miRNA-377可结合早期生长反应因子(early growth response l,Egr1)的3′非翻译区，进而直接抑制Egr1的mRNA翻译及其蛋白表达，还可抑制经血管紧张素Ⅱ诱导后的肝细胞增殖活性以及经血管紧张素Ⅱ刺激后的α平滑肌肌动蛋白、FSP1和Collagen Ⅰ的表达，从而改变肝细胞的增殖活性和病理状态。

4.2 lncRNA lncRNA与肝纤维化密切相关。林嘉裕等[30]的一项荟萃分析结果显示，在肝纤维化中，肺腺癌转移相关转录本1、浆细胞瘤多样异位基因l、被TGFβ活化的长链非编码RNA、铝介导的p21转录调节因子表达上调，母系表达基因3、生长停滞特异性转录因子5、H19、长链基因非编码RNA-p21、缺氧诱导因子1α反义RNA1表达下调；在肝硬化中，铝介导的p21转录调节因子、肝癌高表达基因、lncRNA AK053349、同源框蛋白转录反义RNA转录反义RNA表达上调，长链基因非编码RNA-p21、母系表达基因3表达下调。以上这些基因的生物学作用大多与抑制或促进HSC活化、调节细胞周期、增加或减少细胞增殖与凋亡相关；部分基因通过参与肝脏炎症反应过程促进肝纤维化形成，如肝癌高表达基因和HOX转录反义RNA在乙型肝炎相关肝硬化中表达均上调，肝癌高表达基因还可直接抑制p18表达，促使调节性T淋巴细胞分化，参与肝脏炎症及纤维化过程。

此外，SCARNA10、小核RNA宿主基因7、痒应答基因1的长链非编码RNA(long intergenic non-coding RNA of scrapie responsive gene 1，lnc-SCRG1)与肝纤维化亦存在关联。Zhang等[31]发现SCARNA10的lncRNA ENSMUST00000158992在小鼠纤维化的肝脏中表达上调，SCARNA10的转录产物表达水平在晚期肝纤维化患者的血清和肝脏中增加，且SCARNA10还可通过诱导肝细胞凋亡和HSC活化在体外和体内促进肝纤维化。 Yu等[32]发现，小核RNA宿主基因7(一种新型的lncRNA)可通过减少miRNA-378a-3p的表达并减弱其对蓬乱段极性蛋白2的控制，增强Wnt/β-连环蛋白途径活性，从而促进肝纤维化。Wu等[33]通过微阵列分析发现，lnc-SCRG1(转录长度为3 118 bp的lncRNA)在人肝硬化组织中表达上调13.62倍，定量聚合酶链式反应证实lnc-SCRG1的表达水平随着人肝纤维化的进展而增加；他们还发现lnc-SCRG1可降低三特曲普瑞林蛋白的合成并抑制其靶基因肿瘤坏死因子α和基质金属肽酶2的降解，该研究推测抑制lnc-SCRG1表达可能是诱导HSC凋亡和减轻人肝纤维化的新治疗方法。

5 其他表观遗传机制与肝纤维化

随着表观遗传机制在肝纤维化中的作用不断被证实，有学者根据其机制特点反向探索肝纤维化机制。Pan等[34]的实验结果表明，前列环素合成酶(prostacyclin synthase,PTGIS)基因的启动子在四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型中呈高度甲基化状态，予DNA甲基转移酶的抑制剂处理后，表达下调的PTGIS得到改善，HSC活化被抑制，提示PTGIS在HSC活化中有重要作用。

6 小 结

肝纤维化是肝病发展的初期阶段，如果能在肝纤维化早期控制病情，就能阻断甚至逆转肝纤维化向肝硬化、肝癌发展。表观遗传学机制通过调控HSC及相关信号分子或信号通路，在HSC 的活化、增殖和凋亡中扮演着重要角色，干预肝纤维化的发生发展。虽然表观遗传学机制在肝纤维化中的研究尚浅，相关治疗靶点的循证医学证据尚不足，但这些机制均是肝纤维化潜在的诊断依据和治疗靶点。通过观察肝纤维化过程中的表观遗传学变化，探索肝纤维化的发病机制，可以为肝纤维化的诊断和治疗提供全新方案。