溃疡性结肠炎患者血清miR-15表达水平与炎性反应状态及预后的关系

溃疡性结肠炎(UC)是一种可以损伤肠道黏膜的慢性非特异性炎性疾病[1-2]。UC的病程较长且易反复发作，常表现为血便、体质量降低、高热等[3-4]。一项长期调查发现，随着UC病程延长，病情反复发作，患者癌变的风险也随之增加[5-6]。因此，早期明确UC的病情对于改善患者的预后至关重要。目前临床尚缺乏敏感、准确的生物学标志物以评估患者的病情及预后。有研究表明，miR-15在细胞分化方面发挥着重要的作用[7-8]。有研究指出，miR-15与炎性反应的发生、发展关系密切，miR-15可调控炎性因子的表达水平[9]。UC作为一种炎性肠道疾病，其发病与炎性因子的作用密不可分，因此推测miR-15可能与UC的发生、发展存在联系。目前有关miR-15在UC中的表达及其与UC患者预后关系的报道较少。本研究通过检测UC患者血清miR-15的表达水平，分析其与患者炎性反应程度及预后的关系，以期为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2017年1月辽宁中医药大学附属第三医院及北部战区总医院收治的101例UC患者作为研究对象。所有患者的诊断均符合《中国炎症性肠病组织病理诊断共识意见》[10]。纳入标准：(1)符合UC的诊断标准；(2)入组前未接受对症治疗；(3)对本研究知情同意。排除标准：(1)伴有恶性肿瘤；(2)伴有严重心、肝、肾功能障碍；(3)妊娠期或哺乳期妇女；(4)伴有结肠狭窄、梗阻、穿孔、中毒性结肠扩张等；(5)伴有精神疾病或认知功能障碍，无法配合完成本研究。另选取同期50例健康体检者作为对照组。

101例UC患者中缓解期45例，活动期56例。UC缓解期中男性23例，女性22例，平均年龄为(40.93±5.73)岁，体质指数(BMI)为(21.37±3.48)kg/m2。UC活动期男28例，女28例，平均年龄(40.41±5.55)岁，BMI为(20.90±3.37)kg/m2。对照组中男性有22例，女性有28例，平均年龄为(38.74±5.80)岁，BMI为(22.16±4.02)kg/m2。3组受试者的性别(χ2=0.577，P=0.749)、年龄(F=1.973，P=0.143)、BMI(F=1.614，P=0.203)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会批准同意。

1.2 血清学指标检测

抽取受试者空腹外周静脉血5 mL，在4 ℃下以4 000 r/min离心15 min，分离上层血清，采用速率比浊法检测C反应蛋白(CRP)水平，试剂盒购自北京康思润业生物技术有限公司(批号E0516141116)；采用间接免疫荧光法检测抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)，试剂盒购自欧蒙(杭州)医学实验诊断有限公司(批号E0601141201)，ANCA阳性样本逐渐稀释至1/1024确定滴度，将滴度转换为整数：阴性=0、1/16=1、1/32=2、1/64=3、1/128=4、1/256=5、1/512=6、1/1024=7。采用HE染色测定基底浆细胞，基底浆细胞增多指黏膜下1/3浆细胞浓密渗透。

1.3 血清miR-15相对表达量检测

抽取受试者外周静脉血10 mL，4 000 r/min离心15 min，分离上层血清，置于-20 ℃冰箱中待测。采用TRIzol试剂(购自美国Thermo公司，批号1405266)提取总RNA。采用TaqMan MicroRNA反转录试剂盒(购自美国Thermo公司，批号1405137)合成cDNA，PCR扩增。反应条件为：95 ℃ 60 s预变性；95 ℃ 15 s，15 s退火，72 ℃ 45 s，40个循环。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt表示miR-15的相对表达量。

表1 引物序列

1.4 炎性反应程度评价

采用Mayo评分评价UC临床活动度，Mayo评分≤2分为症状缓解，3～5分为轻度活动，6～10分为中度活动，11～12分为重度活动[11]。采用改良的Baron评分评价UC镜下炎性反应程度，0分为黏膜血管纹理清晰可见；1分为黏膜轻度病变，血管纹理模糊，黏膜充血但未出血；2分为中度病变，黏膜颗粒样变化且出血；3分为重度病变，黏膜溃疡且出血[12]。

1.5 UC活动期划分

按照UC活动期患者临床严重程度将患者分为轻度组(21例)、中度组(18例)和重度组(17例)。轻度、中度、重度的划分标准见表2[13]。

表2 UC活动期划分

注：中度为介于轻、重度之间

1.6 随访

采用电话随访及复诊等方式对UC患者进行为期2年的跟踪随访，每月随访1次，记录患者的复发情况。随访开展时间为2014年1月18日至2019年1月15日。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 3组受试者血清miR-15相对表达量比较

对照组、UC缓解期和UC活动期患者血清miR-15的相对表达量分别为0.42±0.07、0.64±0.11和0.97±0.13，3组受试者血清miR-15的相对表达量差异有统计学意义(F=354.262，P<0.001)。UC活动期患者血清miR-15相对表达量明显高于UC缓解期及对照组(q=21.738，P<0.05；q=37.278，P<0.05)，UC缓解期患者血清miR-15相对表达量明显高于对照组(q=14.120，P<0.05)。

2.2 活动期不同程度UC患者血清miR-15相对表达量、Mayo评分及Baron评分比较

3组患者血清miR-15相对表达量、Mayo评分及Baron评分组间比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。重度组UC患者血清miR-15相对表达量、Mayo评分及Baron评分明显高于中度组及轻度组(P<0.05)，中度组患者血清miR-15相对表达量、Mayo评分及Baron评分明显高于轻度组(P<0.05)。见表3。

2.3 活动期UC患者血清miR-15相对表达量与Mayo评分、Baron评分的相关性分析

相关性分析显示，血清miR-15相对表达量与Mayo评分及Baron评分均呈正相关(r=0.474，P<0.001；r=0.365，P=0.006)。见图1。

表3 活动期不同程度UC患者血清miR-15相对表达量、Mayo评分及Baron评分比较()

注：与轻度组比较，aP<0.05；与中度组比较，bP<0.05

2.4 不同预后UC患者血清miR-15相对表达量

101例UC患者随访期间复发率为47.52%(48/101)，未复发率为52.48%(53/101)。复发组患者血清miR-15相对表达量为1.09±0.17，明显高于未复发组(0.58±0.11)，差异有统计学意义(t=17.698，P<0.001)。

2.5 影响UC患者复发的单因素分析

两组患者的年龄、BMI、病变位置、白细胞介素-6(IL-6)、IL-15表达的差异无统计学意义(P>0.05)。复发组患者中女性、基底浆细胞增多的比例高于未复发组，吸烟者比例低于未复发组，且pANCA、CRP、红细胞沉降率水平高于未复发组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表4。

图1 活动期UC患者血清miR-15相对表达量与Mayo评分、Baron评分的散点图 A Mayo评分 B Baron评分

表4 影响UC患者复发的单因素分析

2.6 影响UC患者复发的多因素分析

根据pANCA、CRP、红细胞沉降率及miR-15相对表达量评估UC患者预后的最佳截断点，并将其转换为二分类变量。将单因素分析有统计学意义的因素(性别、吸烟、pANCA、CRP、红细胞沉降率及基底浆细胞增多)作为自变量，将是否复发作为因变量纳入多因素Logistic回归分析。赋值情况：性别(女为1，男为0)；吸烟(否为1，是为0)；pANCA(≥1.85为1，<1.85为0)；CRP(≥0.31 mg/dL为1，<0.31 mg/dL为0)；红细胞沉降率(≥13.26 mm/h为1，<13.26 mm/h为0)；基底浆细胞增多(是为1，否为0)；miR-15相对表达量(≥0.87为1，<0.87为0)；复发(是为1，否为0)。结果显示，性别、吸烟、pANCA、基底浆细胞增多、miR-15相对表达量与UC患者复发密切相关。见表5。

表5 影响UC患者复发的多因素Logistic回归分析

3 讨论

miR-15是一种功能性miRNA，近年来大量研究指出miR-15与多种炎性疾病关系密切[14]。Zhang等[15]研究指出，miR-15在UC患者中异常表达，其能通过调节炎性因子水平参与UC的发生、发展过程。但关于miR-15与UC患者病情严重程度及预后的关系尚未见报道。

本研究比较了不同分期UC患者血清miR-15相对表达量，结果显示UC活动期患者血清miR-15相对表达量明显高于UC缓解期及对照组，提示miR-15可能与UC患者的病情存在联系，miR-15或可作为评估UC病情的潜在生物学标志物。本研究进一步分析了血清miR-15相对表达量在UC活动期不同严重程度患者中的表达情况，结果发现重度组患者血清miR-15相对表达量高于中度组及轻度组，推测miR-15相对表达量可能与疾病严重程度存在联系。为验证推测，本研究对血清miR-15相对表达量与Mayo评分及Baron评分之间的相关性进行探讨，结果显示血清miR-15相对表达量与Mayo评分及Baron评分呈正相关，提示UC患者血清miR-15相对表达量与UC患者的严重程度及炎性反应程度密切相关。此外，本研究对UC患者进行为期2年的随访观察，发现共有48例患者复发。既往研究显示，UC反复发作会使肿瘤的发生率升高，因此早期评估影响UC患者复发的相关因素具有重要意义[16]。本研究采用多因素Logistic回归法分析影响UC患者复发的因素，结果显示性别、吸烟、pANCA、基底浆细胞增多与UC患者的复发密切相关，与国外报道的结论相似[17]。女性复发率高主要与情绪因素有关，精神因素能通过改变下丘脑-垂体-肾上腺轴、细菌及黏膜之间的相互作用，进而影响黏膜炎性细胞，导致UC复发。吸烟者的复发率较低，可能与香烟中尼古丁可促进血液循环，而CO可抑制炎性反应发生有关。pANCA及基底浆细胞增多均提示黏膜愈合时间的延长，而愈合时间越长，受到炎性因子侵袭的概率越高，复发的概率也将升高。本研究结果提示，miR-15相对表达量是UC复发的危险因素，可能与miR-15可以调节炎性因子参与UC的发生、发展过程有关。综上所述，血清miR-15与UC患者的炎性反应程度关系密切，监测miR-15表达水平有助于改善患者的预后情况。