槐角多糖抗氧化活性研究

王杰，刘瑞珍，刘东超，李慧，刘忠华，*

（1.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083；2.烟台市森林资源监测保护服务中心，山东烟台264013）

槐角是一种传统中药材，以其为原料制成的槐角茶有软化血管、疏风热、抑菌消炎、润肠通便之效，尤其对降三高有极好疗效，受到广大老年人的欢迎。槐角药理功能源于其中的活性物质组分，如黄酮、异黄酮以及三萜皂苷等[1-3]，随着现代分离技术的发展，更多活性物质被发现，其主要成分多糖也受到研究关注[4]，方艳夕等[5]研究发现槐角多糖中主要单糖成分为葡萄糖、果糖；槐角果皮多糖和种子多糖有吸湿保湿的作用，对自由基有一定清除作用[6]。但目前对槐角多糖抗氧化活性研究相对较少，本文以提取的槐角多糖为试验材料，采用自由基评定法对ABTS+自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH 自由基进行了抗氧化活性研究，以期为槐角多糖的综合利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

槐角：河北国安药材批发市场，产自河北国安地区。挑选颜色均匀、形态饱满、果荚完好、无病虫害的槐角，自然晾干，60 ℃烘干 2 h，粉碎、过 20 目筛，干燥存储。

1.1.2 试剂

果胶酶（40 U/mg）、纤维素酶（100 U/mg）、EDAE-52 纤维素柱料、ABTS、DPPH、过硫酸钾（K2S2O8）、磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、FeSO4、水杨酸、30%H2O2试剂、邻苯三酚、硫酸亚铁、苯酚、浓硫酸、无水乙醇：北京化工厂；pUC18 质粒（Takera）、DNA Marker（DL5000）、6×Loading Buffer、Golden View 核酸染料：北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

分析天平（ML104/02）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高速冷冻离心机（CT15RT）：美国Sigma公司；真空冷冻干燥机（FD-80）：北京博医康实验仪器公司；紫外分光光度计（UV-1100）：上海美谱达仪器有限公司；酶标仪（Infinite）：瑞士 Tecan 集团；电泳仪（Power Pac）、紫外荧光凝胶成像仪（Chemi Doc XRS+）：美国BIO-RAD。

1.3 试验方法

1.3.1 槐角多糖提取及分离纯化

1.3.1.1 槐角多糖提取

参照李彩霞等[6]方法，采用超声辅助复合酶解法水提槐角多糖，准确称取5.00 g 槐角粉加入100 mL 蒸馏水，200 W 超声处理20 min 后加入0.05 %混合酶（果胶酶与纤维素酶质量比 1 ∶1），50 ℃水浴 60 min，沸水浴灭酶5 min，6 000 r/min 离心10 min，清液减压浓缩，加3 倍95%乙醇过夜，离心，沉淀加水复溶，加入1/4 体积的Sevage 试剂[7]（三氯甲烷与正丁醇体积比4 ∶1），重复 3～4 次，上清液醇沉过夜，沉淀于-80 ℃预冷12 h，再转至-80 ℃真空冷冻干燥得到槐角多糖（sophorae fructus polysaccharides，SFP）。

1.3.1.2 槐角多糖纯化

将槐角多糖（SFP）用中性去离子水配成100 mg/mL的多糖溶液，取10 mL 离心，上清液缓慢加入DEAE-52 纤维素层析柱，待SFP 全部进入柱料后，向层析柱中加满去离子水，流速为1.0 mL/min，8 mL 每管。分别用 0、0.1、0.3、0.7 mol/L 的 NaCl 溶液线性梯度洗脱。将蒸馏水洗脱组分合并、浓缩、真空冷冻干燥，得槐角次级多糖SFP-1；将NaCl 溶液洗脱的酸性多糖合并、透析、再浓缩后真空冷冻干燥，得到槐角次级多糖SFP-2[8]。

1.3.2 槐角多糖溶液配制

精确称量0.64 g 槐角多糖SFP 及纯化分离后的SFP-1、SFP-2，配制成6.40 mg/mL 的多糖母液，按二倍稀释法稀释成 3.20、1.60、0.80、0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL的样品溶液，4 ℃存放。

1.3.3 槐角多糖抗氧化试验

1.3.3.1 槐角多糖清除ABTS+自由基试验

参照 Yang 等[9]方法修改，ABTS（7.4 mmol/L）与K2S2O8（2.6 mmol/L）等体积混合，4 ℃遮光12 h，用前稀释至734 nm 吸光值为0.700±0.020。准确吸取样品和ABTS 试剂各2 mL，暗反应6 min，立即于734 nm 测吸光值，记为Ai；以等量蒸馏水替代样品，记为A0；2 mL样品与2 mL 的95%乙醇混匀，同样反应时间和波长下测吸光值，记为A1。

式中：Ai为样品试验组吸光值；A1为对照组吸光值；A0为空白组吸光值。

1.3.3.2 槐角多糖清除DPPH 自由基试验

参照 Gong 等[10]方法，精确配制 0.15 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，现用现配。样品与DPPH 溶液各2 mL混匀，暗反应 30 min，517 nm 测吸光值，记为 Ai；蒸馏水替代样品与2 mL 的DPPH 溶液反应，同样操作，记为A0；2 mL 的95%乙醇与2 mL 样品混合反应，吸光值记为A1。

式中：Ai为样品试验组吸光值；A1为对照组吸光值；A0为空白组吸光值。

1.3.3.3 槐角多糖清除超氧阴离子自由基试验

采用邻苯三酚自氧化法，向反应体系中分别加入不同浓度的样品溶液 SFP、SFP-1、SFP-2 各 1 mL，4.5 mL Tris-HCl[50 mmol/L pH（8.1±0.1）]和 3.2 mL 蒸馏水，37 ℃水浴 20 min 后加入 0.3 mL 邻苯三酚（5 mmol/L），于325 nm 处每隔30 s 记录一次数值（以10 mmol/L 的HCl 调零），测 5 min，计算反应速度斜率 ΔAi；对照组以蒸馏水代替样品测吸光值变化斜率，记为ΔA0。

式中：ΔAi为样品吸光值变化的斜率；ΔA0为对照组吸光值变化的斜率。

1.3.3.4 槐角多糖清除羟基自由基试验

参照Chen 等[11]方法调整，配置6 mmol/L 的硫酸亚铁、6 mmol/L 水杨酸-乙醇试剂，现用现配，避光存放。在10 mL 离心管中加入2 mL FeSO4溶液、样品和H2O2（0.3%）各 2 mL，涡旋混匀，室温（25 ℃）放置 10 min，加入 2 mL 水杨酸-乙醇试剂，37 ℃水浴 30 min，510 nm测吸光值记为Ai；以蒸馏水代替样品反应，记为A1；样品2 mL、蒸馏水4 mL 与2 mL 水杨酸-乙醇试剂混合反应，记为A0。

式中：Ai为样品试验组吸光值；A1为对照组吸光值；A0为空白组吸光值。

1.3.3.5 槐角多糖抑制DNA 损伤试验

采用 Fenton 反应体系[12]，取 200 μL 离心管冰浴操作，加入 1 μL 硫酸亚铁溶液 （6 mmol/L）、2 μL 的pUC18 质粒 DNA（0.5 mg/mL）和 5 μL 的磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 7.2）涡旋混匀，加入 2 μL 样品/对照，2 μL 的 H2O2（0.3%），37 ℃水浴孵育 30 min，与 2 μL的6×Loading Buffer 混匀。将凝胶板置于电泳仪中，上样10 μL，150 V 电泳30 min，紫外荧光凝胶成像系统拍照、分析。

1.3.4 数据处理

使用 Excle 2016、SPSS 19.0 和 Origin 8.0 进行统计分析，每组试验均重复3 次，数据用平均值和方差表示显示。

2 结果与分析

2.1 槐角多糖对ABTS+自由基清除作用

ABTS+自由基是ABTS 氧化后产生的，在734 nm处有高吸收峰，呈稳定蓝绿色，与抗氧化物结合后会出现褪色的现象，故可用于测定抗氧化物质的作用效果[13]。槐角多糖对ABTS+自由基清除活性见图1。

图1 槐角多糖对ABTS+自由基清除活性Fig.1 Scavenging activity of SFP，SFP-1，SFP-2 on ABTS+free radical

如图1 可知，样品与ABTS+自由基清除率成量效关系，在最高试验浓度（6.40 mg/mL）时，槐角多糖样品SFP、SFP-1、SFP-2 和对照品 VC的 ABTS+自由基清除率分别是99.73 %、97.54 %、98.36 %、99.81 %。样品SFP-1 和SFP-2 浓度低于3.20 mg/mL 时清除率随样品浓度升高变化速率快，高于3.20 mg/mL 之后趋于平缓；SFP 在浓度 0.05 mg/mL～0.80 mg/mL 时，清除率随样品浓度升高变化速率较快，在浓度高于0.80 mg/mL后，上升趋于平稳。

2.2 槐角多糖对DPPH自由基清除作用

槐角多糖对DPPH 清除作用如图2 所示。

图2 3 种槐角多糖对DPPH 自由基清除活性Fig.2 Scavenging activity of SFP，SFP-1，SFP-2 on DPPH free radical

多糖浓度与DPPH 自由基的清除率成正相关。当浓度为 6.4 mg/mL 时，槐角多糖 SFP、SFP-1、SFP-2 对DPPH 自由基平均清除率可达到64.94 %、87.05 %、86.65%。槐角多糖SFP 在浓度0.05 mg/mL 到3.20 mg/mL之间时，随浓度提高清除率上升迅速，在3.2 mg/mL 到6.4 mg/mL 之间时趋于平稳；槐角多糖纯化分离的次级多糖SFP-1 和SFP-2 作用效果相似，随浓度升高清除率出现交叉：在低浓度0.05 mg/mL～0.10 mg/mL时SFP-2 对DPPH 自由基清除率高于SFP-1，浓度在0.20 mg/mL～0.80 mg/mL 时 SFP-1 对 DPPH 自由基清除率高于SFP-2，在浓度为0.80 mg/mL 时二者对DPPH 自由基清除能力相同，之后随浓度SFP-1 的清除率高于SFP-2，在6.4 mg/mL 时清除率接近相似。

整体来看纯化分离后的多糖SFP-1 和SFP-2 清除率高于槐角多糖SFP，推测可能与各组分中单糖组成、分子量、糖苷键、糖醛酸含量有关。此外，槐角多糖对ABTS 自由基和DPPH 自由基抑制作用基本一致，但对ABTS 自由基清除能力略高，其原因可能与自由基性质有关，ABTS 自由基更适合亲水性抗氧化剂测评[14-15]。

2.3 槐角多糖对超氧阴离子自由基清除作用

超氧自由基是一种活性氧，可与其他分子反应产生羟基自由基、单线态氧等物质，对机体造成直接和间接损伤。槐角多糖对超氧自由基清除活性见图3。

图3 3 种槐角多糖对超氧自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of SFP，SFP-1，SFP-2 on superoxide radical

如图3 槐角多糖样品与对照品对超氧自由基清除能力呈量效关系，但VC的清除能力优于测试多糖样品溶液，在试验最高浓度（6.40 mg/mL）时对照品VC和槐角多糖SFP、SFP-1、SFP-2 对超氧自由基清除率分别是 100.00 %、18.15 %、50.92 %、31.08 %。槐角多糖SFP-1 对超氧自由基清除能力优于SFP 和SFP-2，在浓度0.40 mg/mL～3.20 mg/mL 之间时对超氧自由基抑制能力随浓度升高变化快，超过3.20 mg/mL 后作用效果趋于平缓。

综合来看，槐角多糖SFP、SFP-1 和SFP-2 对超氧自由基清除率表现出SFP-1＞SFP-2＞SFP，多糖的超氧自由基清除能力可能与O-H 键电离能力有关，糖链上连接的羧基、醛基越多，O-H 键越难电离，清除超氧阴离子能力越强。SFP-1 对超氧阴离子自由基清除能力较高，因而推断SFP-1 可能含有较多的醛酸基团[16]。

2.4 槐角多糖对羟基自由基清除作用

羟基自由基是机体中最为活跃的自由基，可对细胞造成直接损伤，是评价抗氧化的重要指标。槐角多糖对OH-·的清除作用如图4 所示。

图4 槐角多糖对羟基自由基清除活性Fig.4 Scavenging activity of SFP，SFP-1，SFP-2 on hydroxyl radical

在试验最高浓度 6.4 mg/mL 时，VC和样品SFP、SFP-1、SFP-2 对羟基自由基清除能力分别是98.68%、95.64%、87.49%、93.95%，VC溶液平均清除率均高于槐角多糖溶液。在较低浓度0.05 mg/mL～0.40 mg/mL 时SFP-2 对羟基自由基清除能力高于SFP-1，之后随浓度升高SFP-2 清除能力略低于SFP-1，但在3.20 mg/mL～6.40 mg/mL 之间时再次超过SFP-1。对比槐角多糖SFP 与SFP-1 可知，当溶液浓度低于1.6 mg/mL 时SFP对羟基自由基清除率高于SFP-1，但浓度在3.20 mg/mL时出现转折，SFP 对羟基自由基的清除率低于SFP-1，并在实验最高浓度6.4 mg/mL 时再次高于SFP-1 的作用效果。清除OH-·能力与多糖中羟基数量、氨基基团有关，推测槐角多糖的糖链中含有较高的羟基含量，与单糖组成有关[17]。

2.5 槐角多糖抑制DNA损伤作用

羟基自由基可直接造成DNA 损伤，采用Fenton反应测定槐角多糖对由羟基自由基造成DNA 损伤的抑制作用[18]，结果如图5 所示。

图5 槐角多糖抑制羟基自由基造成的DNA 损伤电泳图Fig.5 DNA damage electrophoresis of SFP and SFP-1 inhibiting hydroxyl radicals

对照组、试验组与空白组DNA 电泳条带，均有不同程度的开环和开链现象；而与对照组相比，试验组均表现出抑制DNA 损伤作用，样品SFP 和SFP-1 随浓度升高抑制DNA 损伤效果越明显，在浓度3.2 mg/mL时，SFP 的开链结构含量高于SFP-1，即SFP 抑制DNA损伤能力低于SFP-1，在浓度6.4 mg/mL 时，SFP 的开链结构含量低于SFP-1，即SFP 抑制DNA 损伤作用高于SFP-1。

3 结论

槐角多糖通过自由基评价法对各组分抗氧化活性研究表明，虽然试验样品溶液与对照品VC溶液相比抗氧化能力略低，但3 种纯化分离的槐角多糖SFP、SFP-1 及SFP-2 均表现出较好的抗氧化作用。在试验最高浓度6.4 mg/mL 时，槐角多糖SFP 对ABTS+自由基、DPPH 自由基、超氧阴离子自由基及羟基自由基清除能力分别为99.73 %、64.94 %、18.15 %及95.64 %；槐角次级多糖SFP-1 对ABTS+自由基、DPPH 自由基、超氧阴离子自由基及羟基自由基的清除率可达到97.54%、87.05%、50.92%及87.49%；槐角次级多糖SFP-2 对4 种自由基清除率依次为98.36%、86.65%、31.08%及93.95%。在羟基自由基抗氧化试验基础上，槐角多糖SFP 和SFP-1 对DNA 损伤的抑制作用结果显示，槐角多糖对羟基自由基造成的DNA 开链、开环有保护作用。研究说明槐角多糖具有较好的抗氧化能力，其在生物制药、保健食品、化妆品等方向具有一定的开发潜力[19-20]。