山东省不同地区灰飞虱对溴氰虫酰胺的敏感性及亚致死剂量溴氰虫酰胺对灰飞虱解毒酶活性的影响

张凯伦，李忠芹，丁 杰，杜若诗，赵晓雨，夏晓明

(山东农业大学植物保护学院，泰安 271000)

灰飞虱Laodelphaxstriatellus(Fallén)属半翅目飞虱科灰飞虱属，是为害水稻、小麦、玉米和大麦等禾本科作物的重要农业害虫，主要分布在亚洲和欧洲的温带和亚热带地区，在我国长江流域和黄淮地区为害严重(Xuetal., 2014; 毛旭连等，2016; Weietal., 2017; 徐鹿等，2018)。灰飞虱既可以直接为害作物，还可传播水稻条纹叶枯病(rice stripe virus, RSV)、黑条矮缩病(rice black streaked dwarf virus, RBSDV)和玉米粗缩病(maize rough dwarf virus, MRDV)等病毒病害(Wuetal.，2001；林凌伟等，2001)，其传毒为害造成的损失远远大于直接刺吸为害(王彦华等，2010)。

灰飞虱的防治一直以化学防治为主，但是，由于化学杀虫剂的长期不合理使用，导致灰飞虱对生产中常用的杀虫剂产生了不同程度的抗药性(焦文娟等，2016)。目前，灰飞虱已对生产中常用的有机磷类、氨基甲酸酯类、菊酯类、新烟碱类以及氟虫腈、吡蚜酮和噻嗪酮等杀虫剂都产生了不同程度的抗药性(王利华等，2008；Xuetal., 2014; 班兰凤等，2015；毛旭连等，2016；徐鹿等，2018)。抗性问题已成为导致虫害爆发并传播流行性病毒的重要因素(Wangetal., 2010)。

溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)是杜邦公司继氯虫苯甲酰胺后成功开发的一个新型邻氨基苯甲酰胺类杀虫剂(余慧灵，2015)，可通过激活靶标害虫的鱼尼丁受体(ryanodine receptor，RyR)，释放横纹肌和平滑肌细胞内的钙，导致害虫麻痹死亡(潘飞等，2014；周操等，2016)。相比于氯虫苯甲酰胺，溴氰虫酰胺拥有更广的杀虫范围，除了可以直接杀害咀嚼式口器的鳞翅目和鞘翅目害虫，对于半翅目等类型害虫也具备一定杀伤作用(胡译文等，2016)。在我国，溴氰虫酰胺单剂已登记在黄瓜、大葱、番茄、棉花、水稻、西瓜、小白菜、豇豆上，用于防治二化螟、蓟马、甜菜夜蛾等多种害虫。溴氰虫酰胺与噻虫嗪复配登记在玉米上，用于防治玉米蓟马、蛴螬和小地老虎；与三氟苯嘧啶复配登记在水稻上，防治水稻稻飞虱、稻纵卷叶螟和二化螟。

研究表明，溴氰虫酰胺对白背飞虱3龄若虫和成虫均具有较好的室内毒力，且对灰飞虱具有较好的速效性(刘磊磊等，2015；郭晨亮等，2016)。但尚未见田间灰飞虱对溴氰虫酰胺敏感性的相关报道。此外，杀虫剂施用于田间后，随着时间的推移和个体接触药剂的差异，除了对靶标害虫有直接的杀伤作用外，还对非靶标害虫和部分抗药性靶标害虫存在着亚致死效应。亚致死剂量的杀虫剂会给害虫的解毒酶系提供持续的选择压力诱导抗性的演化，加速昆虫抗药性的发展(Guedesetal., 2014; 陈羿渠等，2017)。当溴氰虫酰胺被施于田间防治水稻和玉米害虫时，不可避免地会对灰飞虱产生致死和亚致死效应。

本研究采用稻苗浸渍法和点滴法分别测定山东地区的6个灰飞虱种群对溴氰虫酰胺的敏感性，并分析比较了两个亚致死剂量溴氰虫酰胺对灰飞虱成虫体内解毒代谢酶活性的影响，旨在明确山东省田间灰飞虱对溴氰虫酰胺的敏感性现状，以及灰飞虱体内代谢溴氰虫酰胺的主要解毒酶，为后期在田间科学、合理使用溴氰虫酰胺防治灰飞虱提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源及饲养

泰安种群：2016年8月采自泰安玉米田；莱芜种群：2016年8月采自莱芜小杨庄玉米田；济阳种群：2016年10月采自济阳小麦田；鱼台水稻种群：2016年10月采自鱼台县水稻田；济南种群：2017年4月采自山东省济南郊区水稻田；鱼台小麦种群：2017年5月采自鱼台县小麦田。

采集的灰飞虱以未接触农药的武育粳3号水稻饲养繁殖，试虫饲养采用无土水稻育苗法。将水稻种子进行漂洗后以清水浸泡催芽3 d，每天换水2次。将一层吸水纸铺在饲养盒(35 cm×25 cm×15 cm)中，之后将出芽后的种子均匀撒在吸水纸上。用保鲜膜密封，保鲜膜扎孔，等待水稻出苗。水稻苗长至3 ～5 cm时，将灰飞虱转移至盒内饲养，并用纱布覆盖封口。每两周左右的时间更换水稻苗以保证灰飞虱的营养供给。灰飞虱饲养条件为：温度25±1℃，相对湿度70%±5%，光照L ∶D=16 h ∶8 h。

1.2 供试药剂与仪器

94%溴氰虫酰胺原药(上海杜邦农化有限公司)、α-乙酸萘酯(α-NA)(上海麦克林生化科技有限公司)、固蓝RR盐(上海麦克林生化科技有限公司)、对硝基苯甲醚(上海麦克林生化科技有限公司)、1-氯-2, 4-二硝基苯(CDNB)(上海麦克林生化科技有限公司)、还原型谷胱甘肽(北京索莱宝科技有限公司)、NADPH(北京索莱宝科技有限公司)、NaH2PO4(天津市凯通化学试剂有限公司)、Na2HPO4(天津市凯通化学试剂有限公司)、NaOH(天津市凯通化学试剂有限公司)、37%盐酸(天津市凯通化学试剂有限公司)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)全自动酶标仪680型(Bio-Rad公司)、Neofuge 13 R高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司)、手动微量点滴仪(Hamilton)。

1.3 生物测定

1.3.1稻苗浸渍法

参照王利华等(2008)和班兰凤等(2012)报道的稻苗浸渍法，并略作改进。在电子天平上称取一定量溴氰虫酰胺原药，用少量丙酮溶解，然后用0.1%吐温80依次稀释成40 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、5.0 mg/L、2.5 mg/L一系列浓度。将6日龄武育粳3号稻苗连根一起在系列浓度的药液中浸10 s，每个浓度重复3次，以不含药剂的处理做空白对照，取出沥至无液体滴下，晾干后以湿脱脂棉包住根部放入透明的试管中。用吸虫器将试虫移入试管(2 cm×20 cm)中，每管15头，3个重复，共45头，然后用纱布封口，以防湿度过大增加死亡率和飞虱逃逸。待试虫全部爬上稻苗或试管壁后，剔除机械损伤的个体，并补足15头。接虫后把试管放入温度25±1℃,光周期为16 h ∶8 h(光照 ∶黑暗)的培养箱中饲养。处理3天后，检查死虫数。

1.3.2点滴法

参照Endo等(2000)方法，并略作改进。在电子天平上称取一定量溴氰虫酰胺原药，用丙酮溶解，配制成一定浓度的母液，然后用丙酮将其稀释成一系列浓度20 mg/L、10 mg/L、5.0 mg/L、2.5 mg/L、1.25 mg/L。CO2轻度麻醉(50 ～60 s)试虫后，用手动微量点滴仪(0.2 μL)将药液点滴于飞虱胸部背板，每浓度15头试虫，重复3次，每处理共45头，以丙酮为对照。处理后的试虫转入装有新鲜无毒稻苗的试管(2 cm×20 cm)内，饲养条件为温度25±1℃，光周期16 h ∶8 h(光照 ∶黑暗)，处理24 h后检查结果。

1.4 亚致死剂量溴氰虫酰胺对灰飞虱解毒酶活性的影响

1.4.1试虫处理

选择鱼台小麦种群作为供试试虫。根据前面点滴法测定结果，溴氰虫酰胺对鱼台小麦种群成虫的LD10和LD30分别为0.2431 μg/头和0.5891 μg/头。参照1.3.2部分描述的点滴法，用这两个浓度的溴氰虫酰胺分别处理鱼台小麦灰飞虱种群成虫，每个浓度处理300头，重复3次，以丙酮处理为对照。分别在处理6 h、12 h、24 h和48 h后，从不同处理的灰飞虱成虫中取生长发育一致的存活成虫，用液氮速冻后放入-80℃冰箱保存备用。

1.4.2酶液制备

取不同处理中的试虫各20头，用1 mL磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH7.6)匀浆，然后在10 000 r/min、4℃离心15 min，取上清液作酶液备用。

1.4.3酯酶(esterases, ESTs)活力测定

参照Han等(1998)的方法。在10 mL 0.2 M pH 6.0磷酸缓冲液中加入20 mg固蓝RR盐和0.2 mL 100 mM α-乙酸萘酯乙醇溶液，振荡混匀后过滤得黄色澄清的底物和显色剂混合液(需现用现配)。在96孔酶标板中每孔加入20 μL稀释酶液(事先用0.1 M pH 7.6的磷酸缓冲液稀释10倍)和205 μL上述底物和显色剂混液。用酶标仪在波长450 nm下记录光密度值，酶促反应在27℃下进行，每隔30 s记录一次，反应15 min。

1.4.4谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferases, GSTs)活力测定

参照Kao等(1989)的方法。在酶标板中加入0.6 mmol/L 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)50 μL 和6 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)100 μL，再加入100 μL酶液。利用酶标仪测定D340值，记录10 min内D340变化值，隔20 s记录一次，共记录31次。酶促反应温度为27℃。

1.4.5多功能氧化酶(mixed-function oxidase, MFO)活力测定

参考Shang等(1984)的方法。在酶标板中加入1.0 mmol/L对硝基苯甲醚50 μL和1.0 mmol/L还原型辅酶Ⅱ(NADPH)50 μL，再加入100 μL酶液。利用酶标仪测定D405值，记录15 min内D405变化值，隔20 s记录一次，共记录46次。酶促反应温度为27℃。

1.4.6蛋白质含量的测定

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒，制作标准曲线，根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

1.5 统计分析方法

采用DPS统计软件进行统计分析，计算出溴氰虫酰胺对每个地区灰飞虱的毒力回归方程式、LC50(LD50)值及其 95%置信限、b值及其标准误，并采用Duncan氏新复极差法分析解毒酶活性的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 山东省不同地区灰飞虱对溴氰虫酰胺的敏感性

采用稻苗浸渍法和点滴法分别测定了溴氰虫酰胺对山东省6个灰飞虱种群的室内毒力。稻苗浸渍法测定结果见表1和表2，溴氰虫酰胺对6个灰飞虱种群3龄若虫的毒力(LC50)分别为8.5193 mg/L、9.3058 mg/L、9.5712 mg/L、9.8591 mg/L、10.9706 mg/L、11.0524 mg/L，对6个灰飞虱种群成虫的毒力(LC50)分别为10.4245 mg/L、10.7849 mg/L、11.3864 mg/L、11.8968 mg/L、12.2561 mg/L、12.4904 mg/L。溴氰虫酰胺对6个灰飞虱种群3龄若虫和成虫的毒力均是鱼台小麦种群最高，对3龄若虫毒力最低的是济南种群，对成虫毒力最低的是鱼台水稻种群；对同一个种群成虫的毒力略低于对3龄若虫的毒力。点滴法测定结果见表3和表4，溴氰虫酰胺对6个灰飞虱种群3龄若虫的毒力(LD50)分别为0.9239×10-3、0.9272×10-3、0.9526×10-3、0.9832×10-3、1.0859×10-3、1.1318×10-3μg/头，对6个灰飞虱种群成虫的毒力(LD50)分别为1.0933×10-3、1.1498×10-3、1.1666×10-3、1.1685×10-3、1.2087×10-3、1.2619×10-3μg/头。溴氰虫酰胺对6个灰飞虱种群3龄若虫和成虫的毒力也均是鱼台小麦种群最高，鱼台水稻种群最低；对同一个种群成虫的毒力也略低于对3龄若虫的毒力。

表1 溴氰虫酰胺对灰飞虱3龄若虫的毒力(稻苗浸渍法)

表2 溴氰虫酰胺对灰飞虱成虫的毒力(稻苗浸渍法)

表3 溴氰虫酰胺对灰飞虱3龄若虫的毒力(点滴法)

表4 溴氰虫酰胺对灰飞虱成虫的毒力(点滴法)

检测结果表明，溴氰虫酰胺对山东省6个灰飞虱种群的毒力差异不大。若以LC50(或LD50)值的95%置信区间是否重叠作为判断不同药剂之间毒力是否显著的标准(Zhaoetal., 2006；马崇勇等，2007)，山东省6个田间灰飞虱种群对溴氰虫酰胺的敏感性差异不显著，同一地区灰飞虱种群的不同虫态对溴氰虫酰胺的敏感性也无明显差异。

2.2 亚致死剂量溴氰虫酰胺对灰飞虱体内主要代谢解毒酶活性的影响

采用LD10和LD30浓度的溴氰虫酰胺分别处理鱼台小麦灰飞虱种群成虫6 h、12 h、24 h和48 h后，其ESTs比活力分别增加至对照组的1.20倍、1.23倍、1.14倍、1.04倍和1.34倍、1.40倍、1.31倍、1.07倍(图1)；其GSTs比活力分别增加至对照组的2.37倍、1.89倍、1.17倍、1.21倍和3.81倍、2.10倍、1.31倍、1.36倍(图2)；其MFO比活力分别增加至对照组的1.50倍、1.74倍、1.46倍、1.38倍和1.75倍、2.05倍、1.57倍、1.48倍(图3)。

结果表明， 采用亚致死剂量的溴氰虫酰胺处理后6～48 h，灰飞虱成虫体内3种解毒酶的比活力变化基本趋于一致，均呈现先上升后下降的趋势；ESTs和MFO的比活力在处理12 h后达到试验期间最大值，GSTs的比活力在处理6 h后达到试验期间最大值，且增长倍数最高；在相同的处理时间下，LD30处理后的3种解毒酶的比活力始终要高于LD10处理组。

图1 溴氰虫酰胺亚致死剂量处理后灰飞虱体内ESTs的比活力Fig.1 The specific activity of ESTs in Laodelphax striatellus treated with sublethal doses of cyantraniliprole

图2 溴氰虫酰胺亚致死剂量处理后灰飞虱体内GSTs的比活力Fig.2 The specific activity of GSTs in Laodelphax striatellus treated with sublethal doses of cyantraniliprole

图3 溴氰虫酰胺亚致死剂量处理后灰飞虱体内MFO的比活力Fig.3 The specific activity of MFO in Laodelphax striatellus treated with sublethal doses of cyantraniliprole

3 结论与讨论

由于化学防治是当前控制灰飞虱的重要手段，而且灰飞虱对多种药剂产生了不同程度的抗性，可以长期用于防治灰飞虱的高效药剂越来越少，生产中迫切需要补充新的高效药剂来防治灰飞虱(班兰凤等，2015)。溴氰虫酰胺除了对鳞翅目害虫具有很好的活性，对蚜虫、粉虱和飞虱等半翅目害虫也具有优异的活性(杨桂秋等，2012)。目前，有关溴氰虫酰胺对灰飞虱的室内活性或田间敏感性检测尚无报道。本研究测定了溴氰虫酰胺对山东省6个灰飞虱种群3龄若虫和成虫的毒力。结果表明，溴氰虫酰胺无论是对灰飞虱3龄若虫还是成虫都表现较好的室内活性，且若虫和成虫的敏感性差异不大。不同田间灰飞虱种群对溴氰虫酰胺的敏感性差异也不显著。

杀虫剂对害虫的毒力测定和敏感性现状调查是害虫综合防治中杀虫剂选用的重要依据(王利华等，2008)。目前，灰飞虱毒力测定方法主要有点滴法(马崇勇等，2007)、稻茎浸渍法(周操等，2016)和稻苗浸渍法(王利华等，2008)3种。点滴法是害虫对杀虫剂抗性检测的主要方法之一，测得的结果仅表示药剂的触杀活性(马崇勇等，2007)。稻茎浸渍法和稻苗浸渍法可以模拟田间施药后害虫取食或活动过程中受药中毒的情形，主要体现的是药剂的内吸性能，也可体现出一定的触杀作用，能够真实反映药剂对灰飞虱的杀虫活性(刘磊磊等，2015)。而稻苗浸渍法更贴近田间实际用药情况，可以为田间防治提供更准确的信息(王利华等，2008)。本研究表明，无论采用稻苗浸渍法还是点滴法，溴氰虫酰胺均对灰飞虱表现出较好的室内活性，这进一步说明，溴氰虫酰胺具有很好的触杀效果和胃毒效果，并具有很好的内吸活性(杨桂秋等，2012；王荣燕等，2017)。此外，由于溴氰虫酰胺具有极强的内吸和双向传导作用，田间除了喷雾使用外还可以用于灌根或种衣剂处理(王海娜等，2014)。因此，在未来灰飞虱的防治中，溴氰虫酰胺将会成为一种重要的高效杀虫剂。

亚致死剂量的杀虫剂会对昆虫体内的多种酶系产生诱导或抑制作用(Suetal., 2012)，改变昆虫对杀虫剂的代谢，从而影响害虫防治措施的有效性。酯酶(ESTs)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)及多功能氧化酶(MFO)是昆虫体内重要的解毒酶系，通过测定其活性变化来研究杀虫剂的亚致死效应，已经成为毒理学研究的重要内容(Karuppaiahetal., 2015)。Liu等(2014)研究表明，溴氰虫酰胺亚致死剂量LC20和LC50处理小菜蛾3龄幼虫24 h和48 h后，显著提高供试昆虫体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和多功能氧化酶的活性。余慧灵等(2015)研究发现，溴氰虫酰胺亚致死剂量(LC10和LC25)处理甜菜夜蛾幼虫24～96 h后，可诱导试虫体内羧酸酯酶活性和谷胱甘肽-S-转移酶活性呈先激活升高、后抑制降低的趋势，具有明显的剂量效应和时间效应。曾贤义(2017)研究也发现，溴氰虫酰胺亚致死剂量LC30处理烟蚜8～48 h后，烟蚜体内的GSTs和MFO比活力均呈现先上升后下降的趋势，分别在16 h和36 h时达到最大值，并显著高于对照处理。本研究发现，使用LD10和LD30剂量的溴氰虫酰胺处理灰飞虱成虫6～48 h后，灰飞虱体内的3种解毒酶的比活力均呈现先上升后下降的趋势，表现出明显的时间和剂量效应；ESTs和MFO的比活力在处理12 h后达到最大值，GSTs的比活力在处理6 h后达到最大值，均显著高于对照处理。但溴氰虫酰胺亚致死剂量(LC10和LC25)处理甜菜夜蛾幼虫24～96 h后，与对照相比，MFO活性受到明显的抑制作用，且抑制程度与药剂剂量成正比(余慧灵等，2015)。这种差异很可能是由于同一种杀虫剂的亚致死剂量对不同种类害虫体内的解毒酶活性影响有差别造成的(邢静等，2011)。

本研究采用稻苗浸渍法和点滴法，检测了山东省6个灰飞虱种群3龄若虫和成虫对溴氰虫酰胺的敏感性，并测定了亚致死剂量(LD10和LD30)溴氰虫酰胺对灰飞虱成虫体内3种解毒代谢酶活性的影响。研究结果可为田间科学、合理使用溴氰虫酰胺防治灰飞虱提供理论依据。但杀虫剂的亚致死剂量除了影响昆虫体内解毒酶活性，还可能影响昆虫的繁殖力、生长发育、生态行为和抗药性等一系列亚致死效应，且这种效应也会受昆虫性别和处理浓度的影响。因此，溴氰虫酰胺对灰飞虱的亚致死效应还需要深入系统研究。