一例猪伪狂犬病病原的鉴定

黄宇翔，张 军，王志强，邹 跃，陈 亮，吴宪，候美如

（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院 161005）

猪伪狂犬病( Porcine pseudorabies，PR)是由ɑ 疱疹病毒引起的多种家畜和野生动物感染的一种急性传染病。 除猪以外的其他动物发病后表现为发热、奇痒、脑脊髓炎等症状。 该病危害各阶段的猪，新生仔猪常出现神经症状、腹泻、呕吐、生长不良等临床表现，死亡率高达100%；成年母猪和公猪多表现为繁殖障碍以及呼吸道症状，给世界多国养猪业造成重大经济损失。 欧美等一些发达国家，已经根除了此病。 我国也在制定根除计划，但近年来我国多省份仍有该病的报道， 严重影响和危害我国养猪业发展。 本试验从发病仔猪中分离鉴定一株猪伪狂犬病毒，为猪伪狂犬病流行病学调查、 疫苗的研发以及致病机理的研究提供重要的帮助。

1 材料和方法

1.1 病料及试验动物

病料 2017 年齐齐哈尔郊区某猪场发生怀孕母猪流产，3～5 日龄仔猪出现呕吐、腹泻，并伴有神精症状。 剖检死亡仔猪，采取脑、淋巴结、肝、肺等组织。

试验动物 6 周龄BALB/c 小鼠，由哈药生物疫苗有限公司提供。

1.2 试剂及细胞

TIANamp virus DNA/RNA kit 购于OMEGA 公司； 高GC 含量PCR 扩增试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司；琼脂糖购于TaKaRa 公司。 DMEM 培养基，购于GIBCO 公司；优级胎牛血清，购于天津市灏洋生物制品科技有限公司；Vero 细胞由哈尔滨兽医研究所提供。

1.3 病料采集及处理

收集疑似患有PR 的仔猪的脑或淋巴结等组织， 通过无菌的条件下取约1.0g 的组织样品，加入2.0mL 无菌生理盐水，在组织均质破碎仪中处理30s， 将其放置-80℃反复冻融3 次， 随后4℃条件下12000r/min 离心10min；取200μL 上清液用于组织中病毒DNA 的提取，或取上清液经过0.22μm 滤膜过滤后，分装保存于-80℃冰箱保存，用于病毒分离。

1.4 PCR 检测

应用DNA 提取试剂盒提取样品病毒核酸， 并进行PCR 反应试验。 参照文献[1]以PRV 主要毒力基gE 基因序列设计引物进行PCR 扩增， 基因 片 段长为217bp。 引物F1：CACGGAGGAGGAGCTGGGGCT；F2：GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT， 由 上海生工生物工程公司合成。PCR 反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，63℃退火1min，72℃延伸1min，30 个循环；72℃延伸10min。 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 病毒的分离

将PCR 检测结果为阳性的组织样品处理后，取1.0mL 滤过液接种于生长良好单层的Vero 细胞，37℃条件下吸附1h， 弃接种液，加入含2%胎牛血清的DMEM 培养基，置37℃，5%CO2培养箱中培养，如未出现病变盲传几代，待细胞80%发生病变时终止培养，反复冻融3 次后，收集病毒液，置于-80℃保存。

1.6 病毒半数感染量（TCID50）测定

取病毒液，用无血清的DMEM 培养液作10 倍系列稀释，将稀释度为10－1～10－10 的病毒液按100μL/孔接种到长成单层细胞的96 孔细胞培养板上，每个稀释度接种8 孔，同时培养板最后两列接种DMEM 作为对照。 连续4d 观察细胞病变情况，判定结果，按照Reed－Muench 法计算病毒的TCID50。

1.7 动物试验

试验分两组，每组各5 只6 周龄BALB/c 小鼠，一组用200 TCID50稀释毒经腹股沟皮下进行注射，接种量为0.5mL/只。 另一组接种等量的PBS 液作为阴性对照。 每天观察和记录小鼠的临床症状和死亡情况。

2 结果

2.1 病毒培养结果

病料处理液接种Vero 细胞连续传代培养后， 出现了明显的细胞病变，18h 细胞开始变圆，42h 细胞圆缩，聚集，脱落（见图2），60h 细胞严重脱落。

图1 病料组织感染vero 细胞产生细胞病变（10×40）

2.2 TCID50 测定结果

根据分离病毒不同滴度接种Vero 细胞后出现的细胞病变情况，利用Reed-Muench 法进行毒价TCID50测定，结果TCID50＝10-8.1/0.1mL(见表1)。

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2.3 PCR 检测结果动物试验结果

按TIANamp virus DNA/RNA kit 操作说明以病毒培养液为样本提取病毒DNA，以此为模板进行PCR 扩增，结果，可见清析的目的条带（见图2）。

图2 PCR 检测结果

2.4 动物试验结果

BALB/c 小鼠接种该病毒液后出现了典型的PR 症状：发病的小鼠啃咬接种部位， 严重的皮肤出血， 皮毛脱落， 接种120h后，病毒接种组全部死亡。 对照组小鼠无异常变化。

3 讨论

试验从疑似猪伪狂犬病毒感染的病料中分离到一株病毒，经vero 细胞传代培养， 出现了明显细胞圆缩等特征性病变；经PCR 试验检测到特异性目的条带；动物试验出现了典型的PR 症状，这与文献报道一致[2～3]。 以上结果证明此次分离的病毒为猪伪狂犬病毒强毒株。 该猪场一直用进口Bartha k61 弱毒疫苗进行免疫，但是伪狂犬病发生后仍然造成了流产率骤然上升、仔猪腹泻和神经症状，死亡率较高。 经典毒株疫苗是否已经难以抵抗新流行毒株发病还需进一步研究。 该分离毒株可为猪伪狂犬流行病学研究和新型疫苗研发提供有用的生物材料， 对于控制我国猪伪狂犬病的流行具有重要意义。