雌二醇和孕酮对绵羊绒毛膜滋养层多核细胞形成的影响

张 洁,王多智,王晓娟,刘淑英 (内蒙古农业大学 兽医学院 农业部动物临床诊疗技术重点实验室/内蒙古自治区基础兽医学重点实验室,内蒙古 呼和浩特010018)

妊娠是动物繁衍过程中所必须经历的一个阶段,这种生理状态是由各种生殖激素进行调控的,如蜕膜化、植入和分娩,同时也为母体代谢适应和泌乳做出调节[1]。胎盘的形成和发育在妊娠期间起着至关重要的作用[2-3],而不同物种的胎盘结构也不同[4],绵羊的胎盘结构属于子叶型胎盘,从微观组织学结构上属于结缔组织绒毛膜胎盘,其特点是包含多个由绒毛膜滋养层细胞(STCs)和子宫肉阜组成的胎盘瘤[5]。其中一些滋养层细胞发生分化,形成两个细胞核的滋养层细胞,它们称为巨细胞或双核滋养层细胞(trophoblast binucleate cells,TBCs),同时它们在整个妊娠期的不同阶段与子宫内膜细胞融合[6]。由子宫内膜腔上皮细胞(ELECs)与TBCs相互融合产生多核细胞团称为合胞体[7],是哺乳动物特有的结构,这些多核细胞团能够将激素和滋养层细胞蛋白转移到母体循环中[8]。在大多数情况下,无法证明每个胎盘激素直接参与妊娠过程,因为这些激素在每一个空间和时间上都受到若干因素的严格调节,包括通过其他胎盘激素的间接作用。因此,胎盘激素水平的改变可能对不同的妊娠过程产生负面影响,并与不良妊娠有关,而这些激素的缺乏也可能导致胎盘发育的改变[9]。

张微惠等[10]研究发现,人类妊娠早期血清孕酮(P4)由卵巢黄体和妊娠滋养层细胞分泌合成的,而妊娠8周后主要来自胎盘,妊娠12周后胎盘完全形成,血清P4水平将会迅速升高,因此妊娠12 周以前,血清P4的水平是稳定而且不依赖于孕龄的。BUKOVSKY 等[11]研究发现,在人足月胎盘中有雌激素受体m RNA 的表达,雌二醇(E2)通过雌激素受体ERα增强人原代滋养层细胞的合体化。陈诚等[12]研究发现,胎盘内分泌异常会引起疾病的发生,并且在妊娠期间使用药物也会影响胎盘内分泌造成不良妊娠的结果。

近年来的文献报道中,缺少激素对于绒毛膜滋养层多核细胞作用的数据,但可以推测激素的参与对于绒毛膜滋养层多核细胞及胎盘发育有着非常重要的影响。为此本试验采用E2和P4对已建立的STCs和ELECs共培养体系进行刺激,设置不同的浓度组来观察激素对于绒毛膜滋养层多核细胞的形成扮演了什么样的角色。为了进一步探究绒毛膜滋养层多核细胞的形成与生殖激素的关系,本试验设立了激素联合组,从而佐证单激素刺激和联合激素刺激的结果是否一致,进一步探究影响绒毛膜滋养层多核细胞形成的因素,也为绵羊胚胎发育的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源妊娠45～60 d的健康绵羊子宫及胎盘组织由呼和浩特市某屠宰场提供。

1.2 主要试剂E2、P4均购自Sigma公司；D-PBS购自Hyclone公司；DMEM 培养基、0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM 培养基均购自Gibco公司；姬姆萨染色液购自索莱宝公司。

1.3 STCs和ELECs共培养体系的建立本试验所用的原代绵羊STCs和ELECs的培养、鉴定及其培养体系的建立,参照文献[13]。

1.4 E2和P4工作浓度的摸索将E2和P4的浓度用DMEM 培养基稀释为10－6,10－7,10－8,10－9mol/L,在最佳共培养条件下进行培养,经D-PBS进行清洗后,将不同浓度激素按照每孔1 m L 的量进行刺激,37℃、5%CO2细胞培养箱中培养4 h后,用5%多聚甲醛进行固定和染色,在显微镜下观察滋养层多核细胞的数量,每组做3次平行试验。

1.5 E2和P4联合观察根据试验所得到的E2和P4工作浓度,进行E2和P4联合作用的观察,每组重复3次,使用倒置显微镜进行拍照和计数。设置试验分组如下：单激素刺激,E2和P4分别刺激4 h组；双激素刺激,E2和P4共同刺激4 h组；联合刺激组,先E2刺激2 h,再P4刺激2 h组；先P4刺激2 h,再E2刺激2 h组；空白对照组,不加任何激素,换液4 h后观察。

1.6 姬姆萨染色法将12孔板中的细胞经PBS清洗后,用4%多聚甲醛固定20～25 min；PBS清洗3次,每次5 min；把姬姆萨浓缩液和稀释液按照1∶9的比例配置为姬姆萨染色工作液,每孔加入1 m L的染色工作液,摇床上常温染色30～35 min,自来水冲洗,并用滤纸吸干晾干。

1.7 数据分析不同浓度的E2和P4组的绒毛膜滋养层多核细胞数量采用GraphPad Prism 5 软件ANOVA 程序进行显著性比较(P＜0.05),结果以±s形式表示。联合组的结果也以±s形式表示。

2 结果

2.1 绒毛膜滋养层多核细胞的形态观察在倒置显微镜下,可以观察到绒毛膜滋养层多核细胞大多呈不规则形(图1),边缘不整齐,有些呈煎蛋样,细胞形态较其他细胞大且细胞质丰富圆润,细胞核多呈椭圆形或圆形,数量在3个以上,且不靠近细胞中央,位于细胞的一侧。图中箭头所示为绒毛膜滋养层多核细胞。

2.2 E2 最佳工作浓度的确立将E2按照10－6,10－7,10－8,10－9mol/L的浓度进行稀释,均刺激4 h后,滋养层多核细胞的数量随着E2浓度的升高,滋养层多核细胞的数量表现出先增多后减少的趋势,而当E2浓度为10－7mol/L时,细胞的多核数量相对最多；细胞融合率的结果与统计学结果相一致(表1)。

图1 倒置显微镜下绒毛膜滋养层多核细胞的形态(×200) 左.4核；右.3核

表1 不同浓度E2对绒毛膜滋养层多核细胞数量的影响

2.3 P4 最佳工作浓度的确立将P4按照10－6,10－7,10－8,10－9,10－10,10－11,10－12,10－13mol/L的浓度进行稀释,均刺激4 h后,滋养层多核细胞的数量随着P4浓度的升高表现出先减少后增多又逐渐减少的趋势,而当P4浓度为10－7mol/L 时,细胞的多核数量相对最多,细胞融合率的结果与统计学结果相一致(表2)。

2.5 E2 和P4 联合使用结果根据试验所得到E2和P4的工作浓度,进行E2和P4联合作用的观察,其结果如下：E2的加入相对于空白组引起绵羊滋养层多核细胞数量的增加,而P4的加入相对于空白组则不同程度的引起滋养层多核细胞数量的减少,联合组的结果与E2和P4单刺激的结果趋势一致(表3)。

表2 不同浓度P4 对绒毛膜滋养层多核细胞数量的影响

表3 不同激素对绒毛膜滋养层多核细胞数量的影响

3 讨论

妊娠期最典型的特征就是激素水平的急剧变化。在此期间,由胎盘合成和分泌的一些激素调节着妊娠的不同阶段[14],而在胎盘的生长发育过程中,同时也受到各种生殖激素的调控,在整个妊娠期间雌激素和孕激素是变化幅度最大的[15-16]。因此本试验以E2和P4对建立的STCs和ELECs共培养体系进行刺激,设置不同的浓度组以此来观察激素浓度对绒毛膜滋养层多核细胞数量的影响,进一步探究影响绒毛膜滋养层多核细胞形成的因素。

彭秀梅[17]从牦牛输卵管上皮细胞中克隆了牦牛OPN 基因,OPN 会促进受精和胚胎发育；早期黄体阶段牛的输卵管上皮细胞中OPN 的表达水平最高；而E2可以抑制小鼠血管平滑肌中OPN 的表达；P4可促进小鼠皮肤细胞OPN 表达,但是加入E2后其表达有所下降；在羊发情周期子宫中均可检测到OPN,但不同时期其表达水平有所不同,这可能与发情周期的不同阶段其激素含量不同有关；证明E2、P4对于不同哺乳动物输卵管上皮细胞的调控可能存在物种差异性。而刘丽珍等[18]研究发现,蒙古绵羊的P4水平,在妊娠2 d为0.4μg/L,然后升高,在妊娠8～16 d维持在8.3μg/L 左右,而在妊娠19～30 d P4水平有所下降,30 d为2.5μg/L；表明P4在绵羊妊娠过程随着妊娠周期的不同而逐渐变化,同时也证明P4对不同哺乳动物的生理调控也可能存在物种差异性。

张磊等[19]结果表明P4会促进犬子宫组织炎症损伤及促炎因子分泌,其病变严重程度、病程与P4使用剂量和持续时间有关；雌激素则降低相关炎症因子产生,且低浓度的雌激素可以增加子宫对P4的敏感性；说明犬子宫炎症发生过程中P4促进疾病的发生,雌激素却可以有效地保护子宫组织,降低炎症损伤。梁宇翔等[20]研究表明过量的P4会抑制小鼠子宫的蜕膜化,并可能影响人的蜕膜化过程。本试验结果表明,雌激素的加入会造成绵羊滋养层多核细胞数量的增加,而孕激素的加入则引起了滋养层多核细胞数量的减少,与上述的人和牦牛的妊娠早期结果不一致,而与绵羊妊娠早期和激素引起犬发生子宫组织炎症的结果一致。可以猜测在妊娠的不同阶段激素所承担的功能是不同的所以含量也是不同的,且存在物种的差异性。而本试验主要探讨了妊娠中期,胎盘已经成熟,滋养层细胞是孕激素的主要来源,因此本试验添加孕激素反而违背了正常动物机体内孕激素的水平,从而抑制了滋养层细胞的生长,造成滋养层多核细胞的减少；相反,添加P4会促进疾病的发生,因此造成滋养层多核细胞的减少,而雌激素却可以有效地保护子宫组织、降低炎症损伤,因此引起滋养层多核细胞的增多。

王含必等[21]研究发现,在体外培养的人黄体细胞中加入低浓度E2能直接刺激孕激素产生,而当加入过量的E2时,则明显抑制孕激素产生。所以当E2、P4比例不合适,过量的E2干涉孕激素的作用会影响子宫内膜转化,而低浓度的E2可以增加子宫对P4的敏感性。因此雌激素及孕激素之间理想的平衡状态是保证早期正常妊娠的必要条件。本试验研究表明,先加入E2刺激再加入P4,滋养层多核细胞的数量与只加E2试验组明显增多,且均高于空白对照组；而先加入P4刺激再加入E2,滋养层多核细胞的数量与E2＋P4组,只加P4试验组相比也明显增多,且E2＋P4组和之加P4试验组均低于空白对照组,该试验结果的趋势,与上述结果一致。本试验为绵羊胚胎发育机制的研究奠定基础。