应用酵母双杂交技术筛选E种肠道病毒HY12-VP1蛋白的互作蛋白

郑博伟,刘亚静,张泽财,衣 帆,王玮玉,蔡梦露,王浴光,王新平,2∗ (.吉林大学 动物医学

学院,吉林 长春130062;2.教育部人兽共患病研究重点实验室 吉林 长春130062)

酵母双杂交系统是利用酵母转录因子的相关功能特性,通过2个重组蛋白在酵母细胞中因相互作用而靠近,进而引起下游报告基因的激活来捕获新蛋白的一种试验方法。1989 年,FIELD 和SONG等[14]首次提出酵母双杂交系统。真核生物转录因子GAL4包含2个结构上互相独立但功能上却息息相关的结构域:DNA 结合结构域(DNA-binding domain,BD)和转录激活结构域(transcription-activating domain,AD)。BD 可和上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)特异性结合,AD可以激活UAS下游的基因。但是单独的BD 或AD都不能发挥作用,只有BD 和AD 因相互作用而发生空间上的靠近才能激活下游的报告基因,进而通过缺陷型培养基和显色反应即可筛选到阳性菌落。

BEV 感染是近年来国内新发传染病,对其致病机理及如何诱发机体免疫应答的研究鲜有报道[7]。本试验以E种肠道病毒HY12毒株编码的VP1蛋白为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统对MDBK 细胞的cDNA 文库进行筛选,初步发现与HY12-VP1相互作用的潜在蛋白,为后续研究VP1 蛋白在BEV感染过程中发挥的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞及载体HY12病毒株为本实验室从长春某牛场暴发的1起疫病中首次分离到的1株E种肠道病毒,－80℃保存。牛肾细胞(MDBK)、E.coliTOP10 细胞由本实验室保存。酵母菌株AH109、Y187,质粒p GBKT7、p GADT7、p GBKT7-P53、pGBKT7-Lam 由吉林大学动物医学学院寄生虫实验室惠赠。大肠杆菌E.coliTOP10感受态由本实验室制备,－80℃保存。

1.2 主要试剂DNA 胶回收试剂盒、质粒小量提……