大肠杆菌cpxR 和hns 双基因缺失株的构建

胡慧慧,孙亚伟,李文娅,邝启红,孙华润,吴 华,胡功政,苑 丽∗ (.河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州450046;.河南科技学院 动物科技学院,河南 新乡45300)

在肠杆菌科细菌中,质粒接合作用是水平基因传播(horizontal gene transfer,HGT)最主要的方式之一。参与质粒接合作用的调控蛋白有很多,其中H-NS核蛋白[1]Cpx AR/Arc AB 双组分信号转导系统(two-component signal transduction system,TCS)[2]发挥了很重要的作用。H-NS 核蛋白是肠杆菌科细菌中一种核酸样DNA 结合蛋白,能识别和选择性沉默外源性基因,从而可有效避免细菌因获得和表达过多外源性基因而耗费大量的能量[3-5]。双组分信号转导系统是革兰阴性菌体内常见的调控元件之一,能调控多种基因的表达,是目前极具吸引力的对原核生物有高度选择性的抗菌作用新靶标[6],其中Cpx AR 是肠杆菌科细菌中常见的双组分信号转导系统[2]。

采用 Red 同源重组[7-11],对大肠杆菌ATCC25922中cpx R和hns基因进行敲除,构建单/双基因缺失株及它们的回补菌株,为研究H-NS及Cpx AR 互作调控IncFⅡ质粒接合作用的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒菌株:大肠埃希菌ATCC®25922,购自中国普通微生物菌种保存中心,由本实验室保存。质粒:p KD4,两侧含有FRT 位点的卡那霉素抗性(kanr)基因,是基因敲除的辅助性质粒。p KD46,同源重组的协助质粒,含有温度敏感型复制子和氨苄西林(Amp)抗性,经L-阿拉伯糖诱导后能够表达Gam、Beta和Exo等3种同源重组酶。p CP20质粒,具有氯霉素和Amp 抗性,用于消除FRT 位点的kanr基因[12];pBAD/His A 质粒,具有Amp抗性,主要用于构建cpx R和hns的过表达载体。

1.2 培养基及主要试剂LB肉汤、LB琼脂均购于北京路……