荧光定量PCR测定HBV DNA的抗干扰能力评价*

李育敏，阚丽娟，张水兰，汤花梅，许晓清，熊丹，张秀明(深圳市罗湖区人民医院医学检验科，广东深圳 518001)

按照ISO 15189: 2012要求和CNAS-CL02-A009《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》[1]，定量检测方法和程序的分析性能验证应包括抗干扰能力。《乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量检测试剂注册技术审查指导原则》要求必须验证的干扰物质有三酰甘油、胆红素、血红蛋白和IgG。本研究参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)EP7-A2方案[2]，进行系列干扰评价试验，验证血红蛋白、三酰甘油、总胆红素和总IgG对HBV DNA检测的干扰，对存在干扰的物质评价其浓度和干扰程度之间的关系，确定和量化干扰效应，为临床实验室进行分子诊断定量检测方法和程序的分析干扰性能验证提供参考。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 HBV DNA荧光定量PCR试剂盒(批号:2017012，湖南圣湘公司)；cobas®z480全自动荧光定量PCR分析仪(Roche公司)。

1.2配对差异试验 参照EP7-A2方案，验证干扰物是否对荧光定量PCR法测定HBV DNA存在干扰。

1.2.1样本 厂家声明三酰甘油≤3 000 mg/dL(34.0 mmol/L)、总胆红素≤476.0 μmol/L、血红蛋白≤2 g/dL和总IgG≤40 g/L对检测结果无影响。收集三酰甘油、总胆红素和总IgG浓度与厂家声明接近以及溶血(检测血红蛋白浓度)且HBV DNA阴性的血清样本作为干扰物，制备HBV DNA分析浓度在高、低2个水平(103和106IU/mL)的血清样本作为测试样本。配制方法：以三酰甘油为例，取HBV DNA浓度为105IU/mL、三酰甘油<1 mmol/L的血清样本和三酰甘油浓度为34.0 mmol/L、HBV DNA阴性的血清样本，按1∶100比例配制成三酰甘油浓度为34.0 mmol/L、HBV DNA分析浓度为103IU/mL的测试样本(由于稀释比例为1∶100，前者对后者血清样本中三酰甘油浓度的影响可以忽略不计)；HBV DNA分析浓度为106IU/mL水平的测试样本则选取108IU/mL的血清样本以相同方法配制。其余干扰物配制同三酰甘油。对照样本按同样方法配制为HBV DNA分析浓度相同的血清样本，不含血红蛋白，仅含少量三酰甘油(<1 mmol/L)、总胆红素(<6 μmol/L)，与测试样本相比，所含干扰物浓度可忽略不计。但由于总IgG干扰样本浓度较低(40 g/L)，而正常血清中IgG平均浓度约10 g/L，故对照样本选取12 g/L的总IgG正常标本，即约40 g/L的干扰样本与12 g/L的对照样本进行比较。作为干扰物(三酰甘油、总胆红素、血红蛋白和总IgG)的血清均各选择3个与厂家声明的干扰浓度接近的临床样本，3个样本均存在干扰作用再进行剂量效应试验。所有实验样本均排除丙肝DNA阳性。

1.2.2测定流程 取HBV DNA分析浓度分别为103IU/mL和106IU/mL的2个血清样本，每个样本重复测定20次，得到均值和批内标准差(s)。确定最大允许干扰值(dmax)为国家卫生和健康委员会临检中心室间质评评价界限0.4(LOG值)，分别计算2个浓度水平的dmax/s，查附表得出2个浓度水平的重复次数(n)。……