食管鳞癌患者血浆miR-424、miR-92a及miR-130b水平变化及意义

梁卫东，曾小飞，吴鹏，周家田，颜神超

成都医学院第一附属医院,成都 610500

食管癌是世界上常见的高病死率恶性肿瘤之一[1]，食管鳞癌是其主要组织学亚型。由于食管鳞癌早期缺乏特异性症状及体征，患者确诊时大多处于中晚期，其5年生存率为15%～25%[2]。相反，早期确诊食管鳞癌并接受手术治疗的患者5年生存率接近90%[3]。微小RNA(miRNA)是一类单链、保守、20～24个核苷酸长度的非编码小分子RNA。miRNA主要通过与靶基因mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)非特异性结合，抑制其翻译或调节降解以参与肿瘤的增殖、分化、迁移和凋亡[4]。Lawrie等[5]首次在B淋巴瘤患者外周循环血中发现miRNA稳定表达且能在早期被检测出，其异常表达与肿瘤的诊断及预后相关。目前，已相继有研究发现循环miRNA用于胃癌[6]、结直肠癌[7]、肝癌[8]、乳腺癌[9]及宫颈癌[10]的早期诊断，且其特异度及灵敏度均优于传统血清诊断学标志物。已有研究证实，miR-424在子宫内膜癌及肝癌中发挥抑癌基因的作用[11]，且可作为宫颈癌[12]、肝癌[13]和非小细胞肺癌[14]的诊断标志物和预后因子。在食管鳞癌中，miR-424存在异常表达，并且可作用于下游靶位点，抑制肿瘤增殖[15]。在肝癌和结直肠癌患者血浆中可检测到miR-92a异常表达，并且可作为诊断、预后的生物学指标[16]。在食管鳞癌中，miR-92a明显高表达，参与肿瘤的发生发展并可作为预后因子指导后续治疗[17]。此外，有研究发现，miR-130b表达均与食管鳞癌和肝癌的进展和预后密切相关[18]。尽管研究已证实miR-424、miR-92a及miR-130b与食管鳞癌的进展密切相关，但miR-424、miR-92a及miR-130b能否用于食管鳞癌早期诊断尚不清楚。2017年1月～2018年5月，我们检测了食管鳞癌患者血浆miR-424、miR-92a及miR-130b水平，评估其在食管鳞癌中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取成都医学院第一附属医院胸心外科2017年1月～2018年5月收治的食管鳞癌患者43例。纳入标准：①术前未采取包括放疗、化疗在内的任何治疗；②术中均常规行淋巴结清扫术；③手术切除标本送病理检查，最终术后病理检查结果提示为食管鳞状细胞癌。健康体检者43例食管鳞癌患者中，男33例、女10例，年龄40～75(59.16±1.17)岁。根据美国癌症联合会(AJCC)与国际抗癌联盟(UICC)共同制定的食管恶性肿瘤TNM标准进行临床分期，Ⅰ期15例，Ⅱ期13例，Ⅲ、Ⅳ期15例。另选取同期体检健康者43例，男26例、女17例，年龄42～73(57.92±0.93)岁。体检健康者均未发现患有高血压、糖尿病、心脏病及其他恶性肿瘤等病史。本研究经成都医学院第一附属医院伦理委员会批准。研究对象均签署知情同意书。

1.2 血浆miR-424、miR-92a及miR-130b表达检测 食管鳞癌患者于入院次日采集清晨空腹肘正中静脉血5 mL，健康体检者于体检当日采集空腹肘正中静脉血5 mL，置于EDTA-K2抗凝真空采血管中，室温放置1 h，于4 ℃，3 000 r/min离心10 min，取上清转入1.5 mL RNase-free EP管中，于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清转入1.5 mL RNase-free EP管中，置于-80 ℃深低温冰箱中保存。根据北京TIANGEN公司提供的miRNA提取分离试剂盒进行血浆总RNA提取，使用超微量核酸蛋白测定仪(Thermo Scientific)检测RNA纯度，并采用电泳技术进行RNA定量分析。根据北京TIANGEN公司提供的miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒，冰上配置反应体系：Total RNA 5 μL，2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 3 μL，按以下反应条件进行逆转录：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。通过miR Base数据库查询获得基因序列，由四川生工科技有限公司合成提供引物(miR-424正向引物：5′-GAUACAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAAGUGU-3′，miR-424反向引物：5′-CAGTGCGGTGTCGGTTGAGGT-3′；miR-92a正向引物：5′-GAUUGCACUAGUCCCGGCCUUC-3′，miR-92a反向引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；miR-130b正向引物：5′-GACACUCUUUCCCUGUUGCACUACU-3′，miR-130b反向引物：5′-CGCAGTGCAATGATGAAAGG-3′；U6正向引物：5′-GTTTTGTAGTTTTTGGAGTTAGTGTTGTGT-3′，U6反向引物：5′-AACCGTTCTACCGATGTTGGT-3′)。根据北京TIANGEN公司miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒，以上述合成的cDNA为模板，U6为内参，冰上配置10 μL反应体系：2×miRcute Plus miRNA Premix 5 μL，Forward Primer 0.25 μL，Reverse Primer 0.25 μL，miRNA第一链cDNA 0.5 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL，ddH2O 3 μL，每项反应均设置3个复孔。反应条件：95 ℃ 15 min起始模板变性；94 ℃ 20 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，5个循环；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，45个循环退火、延伸；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s溶解曲线分析。计算不同样品平均Ct值，以2-ΔCt法分析目的基因相对表达量，ΔCt食管鳞癌=Ct食管鳞癌-Ct内参，ΔCt对照组=Ct对照—Ct内参，2-ΔCt为食管鳞癌或健康人目的基因的表达量。

2 结果

2.1 食管鳞癌患者及体检健康者血浆miR-424、miR-92a及miR-130b水平比较 食管鳞癌患者和体检健康者血浆miR-424相对表达量分别为0.291 3±0.079 0、0.121 6±0.031 7，二者表达比较，P=0.001 2；食管鳞癌患者和体检健康者血浆miR-92a相对表达量分别为4.698 0±0.462 8、1.571 0±0.092 8，二者表达比较，P<0.000 1；食管鳞癌患者和体检健康者血浆miR-130b相对表达量分别为3.816 0±0.417 0、1.042 0±0.084 9，二者表达比较，P<0.000 1。

2.2 血浆miR-424、miR-92a及miR-130b水平与食管鳞癌患者临床病理特征间的关系 见表1。

表1 血浆miR-424、miR-92a及miR-130b水平与食管鳞癌患者临床病理特征间的关系

2.3 血浆miR-424、miR-92a及miR-130b在食管鳞癌中的诊断价值 制作的ROC曲线示，血浆miR-424用于食管鳞癌诊断对应的AUC为0.703(95%CI:0.595～0.797)，miR-92a对应的AUC为0.720(95%CI:0.613～0.812)，miR-130b对应的AUC为0.862(95%CI:0.771～0.927)；而血浆miR-424用于诊断食管鳞癌的特异度及灵敏度为72.09%和62.79%，血浆miR-92a对应的特异度及灵敏度为51.84%和88.37%，血浆miR-130b对应的特异度及灵敏度为90.70%和81.40%。

3 讨论

临床资料表明，对于早期食管鳞癌患者，术后5年和10年生存率明显优于中晚期患者。然而，由于食管鳞癌患者缺乏早期特异的症状及体征，加上目前检查手段的局限性，导致食管鳞癌患者预后欠佳。miRNA已被证实可同时存在于恶性肿瘤组织和血浆中，参与肿瘤的生物学进程且作为新的生物学指标指导后续诊断和治疗[6～10]。循环miRNA较短，且具有茎环结构，从而具有耐受RNA酶的高度稳定性，其在血浆或血清中能稳定存在，加之其特异性和独特的表达模式，因此可作为恶性肿瘤诊断的新型生物学标志物。本研究发现，食管鳞癌患者血浆miR-424、miR-92a及miR-130b表达均明显高于健康人；血浆miR-92a、miR-130b表达均与食管鳞癌患者的肿瘤分级、淋巴结转移和TNM分期相关；而低分化患者血浆miR-130b表达较高分化患者显著上调。

miR-424在非小细胞肺癌中表达明显增高，而过表达的miR-424通过作用于TNFAIP1的3′-UTR，促进肿瘤转移[19]。在非小细胞肺癌中，miR-424表达越高的患者往往预后不良，生存期较miR-424低表达者明显缩短，miR-424可作为非小细胞肺癌的预后因子[14]。在食管鳞癌中，miR-424表达明显上调，而将其敲除可激活PRKCD及其下游p38 MAPK和JNK信号通路，增加p21蛋白的稳定性，调节细胞周期，抑制食管鳞癌发生发展[15]。本研究发现，在食管鳞癌患者血浆中，miR-424表达相对于健康人群明显上调，但其与食管鳞癌肿瘤分级、分化、有无淋巴结转移及肿瘤分期无统计学差异，用于诊断食管鳞癌的特异度及灵敏度仅为72.09%和62.79%，AUC为0.703。此前，血浆miR-424已被表明在肝癌中诊断的特异度和灵敏度分别为90.29%和95.12%[13]，明显优于其单独用于食管鳞癌中的诊断价值。因此，血浆miR-424有望联合其他诊断学标志物，提高其用于诊断食管鳞癌的特异度和灵敏度。

MiR-92a属于miR-17-92a簇，位于13号染色体长臂3区2带至3区3带之间(13q32-33)，其在众多恶性肿瘤中是一个显著扩增的区域。miR-92a表达在肝癌组织中明显增高，实验证实，miR-92a通过抑制FOXA2表达促进肿瘤的侵袭和转移，从而发挥原癌基因的作用[20]。此外，miR-92a同样存在于结直肠癌患者血循环中，并可作为结直肠癌患者预后的生物学标志物[16]。Chen等[21]发现，miR-92a在食管鳞癌组织中上调，并可通过作用于CDH1的3′-UTR，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。除此以外，miR-92a表达还可评估食管鳞癌患者的预后情况，可作为食管鳞癌患者预后的生物学指标。本研究证实，食管鳞癌患者血浆miR-92a表达高于健康人群，伴有淋巴结转移的食管鳞癌患者血浆miR-92a表达较无淋巴结转移患者明显增高，且TNM Ⅲ+Ⅳ期的食管鳞癌患者的血浆miR-92a表达明显高于TNM Ⅰ和Ⅱ期患者，miR-92a用于诊断食管鳞癌的特异度及灵敏度分别为51.84%和88.37%，AUC为0.720，明显优于传统的生物学标志物SCC-Ag(AUC=0.665)和CEA(AUC=0.549)[22]。此前，也尚未见血浆miR-92a单独用于评价食管鳞癌诊断价值的相关报道，因此，血浆miR-92a有望作为早期筛查食管鳞癌的新的生物学标志物。但可能存在样本量不足、检测试剂及个体差异等问题，血浆miR-92a单独用于食管鳞癌诊断的特异度尚未令人满意。结合目前已有研究经验，血浆miRNA联合检测可增加结直肠癌[24]、宫颈癌[25]诊断的特异度和灵敏度，弥补单个血浆miRNA所存在的局限性。因此，血浆miR-92a可结合其他血浆miRNA，提高其用于食管鳞癌的诊断价值。

本研究还检测到血浆miR-130b表达在食管鳞癌患者中明显上调，且与临床病理特征间存在统计学差异，其中T4食管鳞癌患者血浆miR-130b表达均比T1、T2和T3患者增高，T3食管鳞癌患者血浆miR-130b表达与T1间同样有统计学差异；有淋巴结转移的食管鳞癌患者血浆miR-130b表达比无淋巴结转移患者增高；与此同时，低分化患者血浆miR-130b表达较高分化患者上调；TNM Ⅲ+Ⅳ期的食管鳞癌患者血浆miR-130b表达高于TNM Ⅰ和Ⅱ期患者。血浆miR-130b诊断食管鳞癌所对应的AUC为0.862，特异度及灵敏度分别为90.70%和81.40%，相较于上述两种指标，血浆miR-130b用于食管鳞癌诊断的特异度和灵敏度更高。已有研究证实，miR-130b通过结合PTEN mRNA的3′-UTR以降低PTEN蛋白表达，从而促进Akt磷酸化，最终导致食管鳞癌的发生发展。因此，血浆miR-130b在食管鳞癌的发生发展中起重要作用，并有望作为食管鳞癌诊断新的生物学标志物。

此次研究尚存在局限性。首先，研究样本量相对较小；其次，血浆miR-424、miR-92a及miR-130b用于食管鳞癌诊断的特异度和灵敏度尚未令人十分满意，若早期将血浆miRNA进行大范围筛选并将常规生物标志物或其他miRNA组合可能更好。最后，未获得足够的数据进行生存分析，因此，血浆miR-424、miR-92a及miR-130b的预后价值未知，在后续研究中，我们将进行更长时间的随访调查，以评估其在食管鳞癌中的预后意义。

综上所述，食管鳞癌患者血浆miR-424、miR-92a及miR-130b表达均明显高于健康人，血浆miR-424、miR-92a及miR-130b可作为食管鳞癌诊断的新的生物学标志物。血浆miR-92a、130b异常表达可能与食管鳞癌进展密切相关。