肾细胞癌组织中HMGB1、RAGE表达变化及意义

孙祥生，王雪松，吴冰冰

铁岭市中心医院，辽宁铁岭 112000

肾细胞癌(RCC)具有多种病理类型，恶性程度较高，易发生疾病转移和复发[1]。近年来，肾细胞癌发病率呈逐年上升趋势，由于肾癌细胞高表达耐药基因，常规化疗药物对其无显著疗效。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是高迁移率族蛋白家族中一员，广泛存在于全身各组织细胞中，具有多种生物学功能，如参与DNA的重组、修复、基因转录调控、细胞复制及分化成熟、诱导炎性反应等。研究表明，HMGB1在多种肿瘤中呈高度表达，如骨肉瘤、肝细胞癌、口腔鳞状细胞癌、前列腺癌、胃肠道肿瘤等[2]，在癌症进展和预后中亦起重要作用。晚期糖基化终末产物受体(RAGE)是最早发现的HMGB1受体[3]，其可与免疫球蛋白轻链、甲状腺激素运载蛋白等结合，参与炎症反应等病理生理过程，并通过介导HMGB1参与癌细胞的增殖、分化和迁移，在疾病发生发展过程中扮演重要角色[4]。2013年1月～2019年5月，我们检测了肾细胞癌组织与癌旁组织中HMGB1和RAGE表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月～2014年5月于我院住院治疗的肾细胞癌患者88例，纳入标准：①患者符合2009版中国泌尿外科疾病诊断与治疗指南中肾细胞癌的诊断标准[5]，均经术后病理检查明确诊断为肾细胞癌；②患者均为首次诊断肾细胞癌，既往未接受过任何方式的抗肿瘤治疗；③患者临床病理资料完整并接受随访，且均通过患者及家属同意并签署知情同意书。排除标准：①合并其他泌尿系统疾病，如肾炎、泌尿系统感染等；②合并恶性肿瘤。88例患者中男46例、女42例，年龄46～77(65.1±7.7)岁；TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期13例，Ⅲ期38例，Ⅳ期17例；病理分化程度：中低分化53例，高分化35例；有淋巴结转移53例；肿瘤直径<4 cm 26例，≥4 cm 62例。其中TNM分期及病理分化程度参考第八版美国癌症联合会标准[6]。

1.2 肾细胞癌组织与癌旁组织中HMGB1和RAGE表达检测 采用SP法检测肾癌组织及其癌旁组织(距肿瘤边缘大于5 cm)HMGB1和RAGE表达。将手术切除的组织石蜡包埋后制成厚度为5 μm的切片，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡后乙醇梯度水化，PBS浸洗3次，每次5 min，避光条件下3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，PBS清洗3次。将切片放0.01 mol/L(pH 6.0)柠檬酸缓冲液浸泡，100 ℃水浴30 min，自然冷却后PBS清洗，滴加5%兔血清白蛋白封闭液，37 ℃孵育20 min，滤纸吸去血清，滴加HMGB1和RAGE一抗37 ℃孵育2 h，PBS清洗后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素37 ℃孵育15 min，PBS清洗后DAB显色5 min，苏木紫复染1 min，再乙醇梯度水化，中性树胶封片。最后显微镜镜检(×400)。显微镜镜检中，每张切片选取15个视野，每100个细胞中HMGB1和RAGE阳性细胞数的平均数作为细胞阳性率，并将15个视野平均值作为最终结果。结果判读参考文献[7]：根据染色强度和细胞阳性百分数综合打分，0～2分视为阴性，3～6分为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计数资料以例数或率描述，采用χ2检验进行分析。相关性分析使用Spearman相关分析法。建立Kaplan-Meier乘积限模型进行生存分析，两组生存率比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾细胞癌组织与癌旁组织中HMGB1与RAGE表达比较 肾细胞癌组织中，HMGB1主要表达于细胞核或细胞质，免疫组化HMGB1表达阳性细胞呈棕黄色染色。肾细胞癌、癌旁组织中HMGB1阳性表达率分别为87.5%(77/88)、20.4%(18/88)，二者比较差异有统计学意义(χ2=79.617，P=0.000)。

肾细胞癌组织中，RAGE主要表达于细胞膜上，免疫组化RAGE表达阳性细胞呈棕色染色。肾细胞癌、癌旁组织中RAGE阳性表达率分别为82.9%(73/88)、22.7%(20/88)，二者比较差异有统计学意义(χ2=64.048，P<0.001)。

2.2 肾细胞癌组织中HMGB1与RAGE表达的相关性 Spearman相关分析示，肾细胞癌组织中HMGB1与RAGE表达呈正相关(r=0.673，P<0.001)。

2.3 肾细胞癌组织中HMGB1和RAGE表达与患者临床病理特征间的关系 肾细胞癌组织中HMGB1、RAGE蛋白表达与肿瘤临床TNM分期、分化程度及淋巴结转移有关(P均<0.001)。见表1。

表1 肾细胞癌组织中HMGB1和RAGE表达与患者临床病理特征间的关系(例)

2.4 肾细胞癌组织中HMGB1、RAGE表达与患者预后的关系 截至2019年5月， 88例肾细胞癌患者均成功随访3～60个月，无失访案例，29例患者5年内死亡，5年生存率为67.0%。HMGB1阳性77例，其中死亡28例，5年生存率为63.6%(49/77)；HMGB1阴性11例，其中死亡1例，5年生存率为90.9%(10/11)。经Log-rank检验，χ2= 4.738，P=0.028。

RAGE阳性73例，其中死亡27例，5年生存率为63.0%(46/73)；RAGE阴性15例，其中死亡2例，5年生存率为86.6%(13/15)。经Log-rank检验，χ2= 4.383，P=0.036。

3 讨论

肾细胞癌在肾脏恶性肿瘤中约占90%，在成人癌症中占2%～3%[8]。吸烟、肥胖、终末期肾功能衰竭、透析均是肾细胞癌的危险因素[9]。目前肾细胞癌主要治疗方式包括手术、放疗、化疗及分子靶向治疗等，大部分肾细胞癌能被及时发现，但仍有部分患者发现时已处于癌症晚期，预后差，易复发，患者长期生存率低[8]。

HMGB1是一种细胞外信号分子，在真核细胞核中大量存在[10]，人HMGB1基因位于染色体13q12上，由两个DNA结合位点(A-box和B-box)和带负电的C-末端组成[11]。HMGB1在DNA修复和转录、信号传导及体细胞重组中发挥重要作用，如HMGB1与DNA结合，影响某些基因(p53、类固醇激素受体)的转录过程。有研究发现，HMGB1可促进肾癌细胞的增殖和发展，而抑制HMGB1表达却可增强癌细胞的凋亡[12]。本研究结果显示，肾细胞癌组织中HMGB1高表达。可能是高表达HMGB1引起肿瘤表型基因高表达，从而导致肿瘤基因的产生，进一步促进肿瘤发生发展[13]；同时，坏死的肿瘤细胞将HMGB1释放至细胞外，促进周围肿瘤细胞增殖分化和血管生成，使得肿瘤组织持续增大。本研究发现，肾细胞癌组织中HMGB1表达与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移有关。癌细胞侵袭周围组织或发生淋巴结转移是肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞侵袭周围正常组织，且发生血液和淋巴结转移，随着血液和淋巴结循环转移至各个靶器官，在炎症或其他因子的刺激下，肿瘤细胞可分泌出更多的HMGB1蛋白，HMGB1与RAGE、TLR2/4受体结合，激活p38、SPA/JNK、NF-κB等信号通路，进一步激活产生金属蛋白酶MMP-2、MMP-9和凋亡抑制蛋白c-IAP等[14]，纤维蛋白溶酶级联激活金属蛋白酶，降解细胞外基质，使癌细胞浸润、转移到周围正常组织中，从而进一步促进肿瘤的发生发展[15]。

RAGE是多种不同结构分子的配体，是一种跨膜蛋白，由N端、疏水的跨膜段及C端组成。相关研究表明[16]，RAGE在多种肿瘤细胞中均有升高，在肿瘤侵袭、转移过程中发挥作用，且肿瘤组织中RAGE表达远高于癌旁组织，本研究结果与之相同，其机制可能为上调RAGE基因表达时，抑癌基因p53 磷酸化减弱，bcl-2和bcl-xL抗凋亡蛋白表达上调，阻断肿瘤细胞凋亡[17]。本研究结果还显示，肾细胞癌组织中RAGE阳性表达率与肿瘤临床分期、分化程度有关，其机制可能为HMGB1-RAGE轴在肿瘤进展过程中发挥重要作用，癌细胞自分泌大量的HMGB1分子，从而激活受体RAGE的产生，通过激活下游信号通路产生炎症因子，促使肿瘤细胞产生抗细胞凋亡基因、提高对细胞内缺氧状态的耐受能力、干扰抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤细胞增殖，形成正向调控。当下调RAGE的表达时可使肿瘤的分化功能丧失，肿瘤分化程度降低，促使肿瘤恶性程度进一步升高[18]。本研究中，肾细胞癌患者RAGE阳性表达率与淋巴结转移有关，机制可能为RAGE具有高迁移能力，当晚期糖基化终末产物、HMGB1或钙粒蛋白等配体与其结合后，同样激活了细胞内NF-κB等信号转导通路，使癌细胞逐渐向周围正常组织中转移[15]，降解正常组织，促进肿瘤转移，加快肿瘤细胞的浸润性生长。

本研究结果显示，HMGB1与RAGE表达阳性患者5年生存率均低于阴性者，表明HMGB1、RAGE高表达可能与肾细胞癌患者的不良预后有关。本研究结果显示，HMGB1与RAGE表达呈正相关，HMGB1是RAGE最重要的配体，结合后可激活重要的信号通路[15]，如SPA/JNK、NF-κB等。因此二者在癌症发生发展过程中协同发挥作用。

综上所述，肾细胞癌组织中HMGB1与RAGE表达均升高，检测二者表达有助于患者病情判断及预后评估。