HPLC 法同时测定君享片中3 种成分

王 婧 顾 睿胡晗绯柏伟荣朱靖博∗

（1.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港222001； 2.大连工业大学食品学院，辽宁 大连116034）

疲劳属于中医学“虚”“虚劳”“虚损”等范畴，根据中医藏象学说，疲劳与五脏都有联系，疲劳的整体功能状态改变，有赖于五脏的共同调节。君享片经刺五加、肉苁蓉、西洋参、丹参水提、浓缩、喷雾干燥获得干浸膏，添加微晶纤维素混合制粒，与交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁混合压片、包衣制成的具有缓解体力疲劳功效的保健食品。该复方保健食品中标志成分为紫丁香苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷。紫丁香苷有利于能量物质的储存和积累，加速某些导致疲劳代谢物质的清除，维持细胞的正常生理功能，延缓疲劳发生，加快疲劳恢复［1-3］。松果菊苷能拮抗自由基损伤，提高健康小鼠常压耐缺氧和负重游泳时间，增加脾指数和胸腺指数，具有抗氧化、增强免疫力、延缓衰老、抗疲劳作用［4-5］。为了很好的控制其产品质量，需对其指标性化学成分进行含有量测定、质量控制。2015 年版《中国药典》 中松果菊苷和毛蕊花糖苷、紫丁香苷3 种成分分别以不同的流动相及提取方法检测，操作费时。课题组参考多篇文献［6-13］，采用HPLC 法双波长梯度洗脱法同时对君享片中松果菊苷、毛蕊花糖苷及紫丁香苷的含有量进行测定，以期为完善其质量标准提供参考。

1 材料

安捷伦1260 液相色谱仪，配备G1311A 四元泵、G1367B 自动进样器、G1365D 紫外检测器、G1322A 在线脱气机、Agilent Chemstation 色谱工作站（美国Agilent 公司）；XS205 电子分析天平、ME303 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；5424R 离心机（奥地利Eppendorf 公司）；Mill-Q 纯水机（美国Millipore 公司）；KH2200B 超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

紫丁香苷对照品（纯度95.2%，批号111574-201605）、松果菊苷对照品（纯度92.5%，批号111670-201706）、毛蕊花糖苷对照品（纯度96.7%，批号111530-201512）均购于中国食品药品检定研究院。乙腈、异丙醇（色谱纯，美国天地公司）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯（南京化学试剂公司）。君享片（0.92 g／片，60 片／瓶），由江苏康缘药业股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 取紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品适量，加50% 甲醇制成每1 mL 分别含紫丁香苷0.04 mg、松果菊苷0.70 mg、毛蕊花糖苷0.05 mg 的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液 取本品20 片，去包衣，研细，混匀，精密称定粉末0.2 g，置5 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇至接近刻度，超声处理40 min（功率250 W，频率40 kHz），取出，冷却至室温，用50% 甲醇定容，摇匀，高速离心，取上清液，即得。

2.1.3 阴性溶液 取缺刺五加阴性制剂（无紫丁香苷）和缺肉苁蓉阴性制剂（无松果菊苷和毛蕊花糖苷），按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 Waters C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相0.1% 甲酸（A）-（1% 异丙醇-甲醇）（B），梯度洗脱，程序见表1；柱温30 ℃；体积流量0.8 mL／min；进样量10 μL；紫丁香苷检测波长为265 nm，松果菊苷、毛蕊花糖苷检测波长为330 nm。理论塔板数以紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰计达3 000 以上。样品中色谱峰与其他峰能够达到基线分离，保留时间合适。

表1 梯度洗脱程序

2.3 专属性考察 精密吸取阴性溶液、对照品溶液、供试品溶液各5 μL，在“2.2”项色谱条件下进样测定。结果表明，阴性制剂无干扰，供试品溶液中待测成分分离效果较好，色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.4 线性关系考察

2.4.1 对照品溶液制备 精密称取紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品适量，用50%甲醇制成混合对照品溶液（紫丁香苷0.128 mg／mL、松果菊苷2.089 mg／mL、毛蕊花糖苷0.145 mg／mL），倍比稀释得到系列质量浓度。

2.4.2 分析结果 精密吸取松果菊苷和毛蕊花糖苷对照品溶液0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 mL，紫丁香苷对照品溶液0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入50% 甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，分别吸取5 μL，在“2.2”项色谱条件下进样。以峰面积平均值为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程分别为紫丁香苷Y＝17 012X＋20.45（R2＝1.000 0）、松果菊苷Y＝9 151.1X＋138.45（R2＝1.000 0）、毛蕊花糖苷Y＝12 868X＋9.302（R2＝1.000 0），表明紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷分别在0.008 0～0.128 3、0.130 5～2.088 7、0.009 0～0.144 6 mg／mL 范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样6 次，测得紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为0.77%、0.31%、0.39%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下于0、2、4、6、8、12、24 h进样，测得紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为0.90%、0.40%、0.30%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样，测得紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷含有量RSD 分别为2.98%、2.65%、2.33%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成0.110 0、3.125、0.137 5 mg／mL 溶液。

取含有量已知的同一批君享片，去包衣，研细，精密称定6 份，每份0.2 g（批号20170601，紫丁香苷0.610 mg／g，松果菊苷16.11 mg／g，毛蕊花糖苷0.749 mg／g），置5 mL 棕色量瓶中，加入1 mL 对照品溶液，挥干，按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，在“2.2”项色谱条件下进样，计算回收率。结果，紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷平均加样回收率（RSD）分别为95.40%（1.10%）、103.30%（1.17%）、103.30%（1.10%），见表2。

2.9 样品含有量测定 取3 批君享片，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下各进样10 μL测定，外标法计算含有量，结果见表3。

3 讨论

本实验考察0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-1%异丙醇-甲醇流动相，结果表明，减少甲醇比例后毛蕊花糖苷分离度有所提升，但仍无法达到基线分离，因此更换甲醇为1%异丙醇-甲醇。此时，供试品中紫丁香苷、松果菊苷色谱、毛蕊花糖苷色谱峰均达到基线分离，保留时间合适。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）

表3 各成分含有量测定结果

在供试品溶液制备时，本实验分别对不同体积分数甲醇（30%、50%、70%）、超声提取时间（20、30、40、50 min）进行考察，结果表明，用50%甲醇作为提取溶剂时，超声40 min 即可提取充分。