乌鲁木齐地区RT-PCR法检测儿童急性呼吸道病毒的临床研究

伊合帕尔·吐依洪 比拉里·艾山 姜敏 张洪平 王晶

新疆维吾尔自治区中医院呼吸科 新疆呼吸病研究重点实验室,乌鲁木齐830000

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infections,ARTIs)是一个持续而普遍的公共卫生问题。在全世界范围内有分布范围广,致死率高的特点,对婴幼儿、老年人以及免疫功能低下人群造成极大威胁[1]。ARTIs可由细菌、病毒和支原体感染引起,而病毒感染是导致ARTIs的非常重要的一种病因[2]。据统计,大约90%的病例为呼吸道病毒感染所导致的。ARTIs发病是由许多因素单独或共同决定的,这些因素包括年龄、性别、营养状况、母乳喂养(类型和持续时间)、社会经济状况和人口分布等[3]。常见的引起呼吸道感染的病毒种类主要包括呼吸道合胞病毒,副流感病毒,流感病毒,肠病毒,腺病毒,人鼻病毒,人后肺病毒,人冠状病毒229E、OC43、NL63、HKU1和SARS[4-8]。近年来,新疆地区干旱少雨,不同季节气候变化明显,昼夜温差较大是呼吸道疾病高发的主要原因。随着疾病治疗过程中抗生素的广泛应用,呼吸道病毒感染较细菌感染呈上升趋势,而探索一种高效、快速检测呼吸道病毒的方法对呼吸道病毒感染诊断和合理用药具有重大的作用。传统的呼吸道病毒的检测方法包括病毒的分离培养、血清学实验以及一些国外开发出的呼吸道病毒快速诊断试剂盒等[9]。然而这些传统的方法耗时较长,过程繁琐,耗费较多的人力物力,且检测效率较低,敏感度和特异度都不高[10-11]。随着PCR技术的兴起,分子生物学方法检测呼吸道病毒应用逐渐广泛。本文通过多重荧光RT-PCR检测了新疆维吾尔自治区中医院2015年1月至2017年12月住院呼吸道分泌物中的人腺病毒(human adenovirus,HADV)、 人 偏 肺 病 毒(human metapneumo virus,HMPV)、人博卡病毒(human bocavirus,HBo V)、人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)4种呼吸道病毒。分析这4种病毒在本地区门诊发热儿童患者中感染情况及与年龄、季节的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2015年1月至2017年12月新疆维吾尔自治区中医院住院患者1 045例。其中男574例,女471例;年龄(4.9±2.7)岁,年龄范围为1～12岁。按文献[3]诊断标准确诊为呼吸道感染。

1.2 临床样本核酸模板的制备 临床样本取自以上1 045例呼吸道疾病患者的咽拭子和含嗽液,加入PBS缓冲液放在4℃冰箱浸泡过夜。提取HADV、HBo V、HMPV、HRSV 4种呼吸道病毒核酸,以引起相似临床症状的其他类型呼吸道病毒(如流感病毒、冠状病毒等)的临床样本作为对照。

1.3 引物与探针设计 参考文献[12],选取HADV、HBo V、HMPV和HRSV 4种病毒基因的高度保守区设计引物,使用Premier 6.0设计特异性引物和Taq Man探针,同时使用Oligo 7软件和NCBI上的BLAST评价引物及探针特异性分析(表1)。引物和探针均由上海生工合成,引物为PAGE级纯化,探针为HPLC级纯化。

1.4 多重荧光逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)反应体系 采用北京全式金公司的Transcript Green One Step RT-PCR试剂盒,根据说明书在反应体系中同时加入4种呼吸道病毒的特异性引物、Taq Man探 针。反 应 体 系 包 括:2×TransStart one-step Reaction Mix 12.5μl,TransStart one-step Enzyme 0.4μl,Primer Script RT Enzyme MixⅡ0.5μl,最后加去离子水补充至25μl,HADV、HBo V、HMPV、HRSV 4种呼吸道病毒的4对上下游特异性引物和探针(浓度分别为40μmol/L和20μmol/L)各0.4μl。阳性孔加入4种呼吸道病毒其中的1种病毒的体外转录RNA 5μl,阴性内参加入去离子水5μl。荧光RT-PCR反应条件为:45℃,15～30 min;95℃,10 s;95℃,5 s;60℃,1 min 40个 循 环,在60℃,1 min阶段收集荧光。

1.5 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析,计数资料用率(%)表示,采用Studentt和χ2检验进行。组间比较和离散变量的关联性分析采用χ2检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 用于4种病毒的荧光RT-PCR的引物及探针

2 结果

2.1 1 045例患儿中4种病毒感染阳性率 1 045例患儿中,呼吸道病毒检测有281例结果为阳性,总阳性率为26.89%。其中,男性患儿中有121例阳性,占比43.06%;女性患儿中有160例阳性,占比56.94%。男女病毒感染比例为0.76∶1。两者阳性率差异无统计学意义(χ2=0.172,P=0.547)。281例阳性患儿中单种病毒感染194例,2种及以上病毒混合感染87例,单科病毒混合病毒感染比例为2.23∶1。

2.2 呼吸道4种病毒感染的构成 281例病毒感染患儿中HMPV感染最多,为120例(42.70%)、其次为HRSV感染119例(42.35%)。4种病毒多重荧光RT-PCR特异性检验结果显示:在194例单种病毒感染患儿HMPV感染率最高,为85例(43.81%),其次为HRSV,为56例(28.87%)。在87例混合病毒感染患儿中HRSV感染率最高,为63例(72.41%),其次为HADV,为58例(66.67%),见表2、3。

2.3 呼吸道4种病毒感染与年龄的关系 表4为4种呼吸道病毒感染和年龄的关系。结果可知≤3岁组阳性229例(36.06%),4～7岁组阳性114例(42.22%),≥8岁组阳性63例(45.00%)。≥8岁组阳性率高于4～7岁组,显著高于≤3岁组(P＜0.05);而4～7岁组和≥8岁组则差异无统计学意义(P＞0.05)。≤3岁组HMPV阳性例数最多,为80例(12.60%),4～7岁组HRSV阳性比例最大,为38例(14.07%)。≥8岁组则以HADV感染比例最大,为26例(18.57%)。见表4。

表2 4种病毒多重荧光RT-PCR体系特异性检验

表3 4种呼吸道病毒组成[例(%)]

2.4 呼吸道病毒感染与季节的关系 由表5可以看出春、夏、秋、冬四季的阳性率分别为25.68%、28.24%、49.34%、65.57%。冬季4种病毒感染阳性率均高于其他3个季节(P＜0.05)。春季病毒感染以HADV和HMPV感染最多;夏季和秋季同样以HMPV病毒感染最多,冬季则以HRSV多发。见表5。

表4 各年龄组4种呼吸道病毒的构成[例(%)]

3 讨论

呼吸道感染是导致小儿发病和死亡的一个重要原因,降低其发病率及病死率,明确病原是首要问题[13]。病毒感染在呼吸道感染中占有非常大的比例。目前认为常见的呼吸道病毒有7种,本文选取4种研究较成熟的病毒作为研究对象,结合新疆季节变化,地域差别以及不同发病年龄,分析4种病毒的流行趋势。目前,大多数呼吸道疾病病毒感染检测基于病毒分离培养,但耗时耗力,同时假阴性结果较多,不能及时指导临床治疗[14]。近年来基于核酸的多重荧光定量RT-PCR法灵敏度和特异度均取得一定成果[15]。本研究1 045例患儿为乌鲁木齐地区2015年1月至2017年12月住院的呼吸道疾病儿童,其中检测出281例阳性,总检出率为26.89%。其中男、女检出率差异无统计学意义(P＞0.05),说明4种呼吸道病毒感染性别差异无统计学意义。

比较以往的研究,广州、重庆等地小儿呼吸道病毒感染以HRSV为主[16-17]。而本研究发现281例病毒感染阳性患儿中HMPV检出率最高(42.70%),其次为HRSV(42.35%)。因此HMPV可能是2015年1月至2017年12月乌鲁木齐地区呼吸道感染首要的病毒病原;同时HRSV也有较高的感染率,仅与HMPV感染相差1例。其次为HADV(35.23%)和HBo V(24.20%)。此外本研究发现2种及以上病毒混合感染率达30.96%(87/281),明显高于以往文献报道的结果[18]。可见,不同病毒的混合感染在小儿呼吸道病毒感染中占有相当一部分的比例。而在87例混合病毒感染中,与HRSV相关的感染最多,表明HRSV易发生混合感染。

从不同年龄组来看,≥8岁组病毒检出率最高,高于4～7岁组,且显著高于≤3岁组(P＜0.05),该结果与文献[19]报道结果不一致,可能是与该阶段入院的≤3岁组患儿基数较大相关。进一步分析发现,HMPV在≤3岁组中检出率最高(12.60%);随着年龄增大,4～7岁组及≥8岁组检出率依次降低。由于婴幼儿期机体免疫低下,体液免疫功能尚未完善,HMPV与喘息性疾病的发生有一定关系;同时HMPV易合并其他病毒感染,故HMPV是婴幼儿期呼吸道感染的防治重点[20]。

呼吸道病毒流行的影响很多,但季节的变化是其主要的原因。本研究患儿呼吸道疾病高发主要为春季,其次为冬季。这可能是由于乌鲁木齐地区冬春交替气温变化较大所致。从病毒感染的结果来看尽管春季患儿较多,但仅较少部分为病毒感染。可能与春季花粉、粉尘等各种过敏原较多有关。因此采用快速准确的病毒检验方法可以避免因过敏引起的呼吸道症状而导致误诊。整体趋势来看,随着季节的变化病毒感染比例有逐渐上升的趋势,这与张雪清等[4]研究相同。冬季呼吸道疾病发生在4个季节中仅次于春季,同时是病毒感染的高发季节,高达65.57%。究其原因可能是乌鲁木齐地区近年来冬季寒冷,气温变化反复,病毒易滋生。不同季节来看,春、夏、秋三季的病毒感染主要病原体分别为HADV、HMPV和HMPV,而冬季以HRSV为主。Feikin等[21]应用RT-PCR的方法检测因呼吸道感染住院的患儿,结果发现HRSV检出率为79.10%,且有86例为混合感染。Cilla等[22]利用PCR和间接免疫荧光方法检测338例1～35个月患儿,HRSV检出率为55.70%;HBoV检出率为54.10%,混合感染61例。以上研究病毒检出率均高于我们的研究,同时幼儿中混合感染的比例均较高。

综上所述,HMPV是本地区小儿呼吸道病毒感染的首要病原,在3岁以下婴幼儿中感染率最高;其次为HRSV,在4～7岁儿童中感染率最高。从季节上来看,婴幼儿病毒感染主要发生冬季,且同季节病毒感染的发病率及病原构成差异较大。多重荧光定量RT-PCR法是一种快速而准确的检测呼吸道病毒的方法,及时的检出病毒对后期疾病及时对症治疗,缩短病程,为临床诊断和治疗提供可靠的科学依据。

表5 各季节4种呼吸道病毒的构成[例(%)]

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突