SIRT2稳定敲除细胞系的建立及对组蛋白修饰的影响

李 雪 裴 培 刘长云 王 珊

CRISPR/Cas9已被证明是一种简单有效的基因组编辑工具[1]。CRISPR-Cas系统(CRISPR-Cas system)可以进行多靶点基因编辑。CRISPR相关内切酶(CRISPR-associated，Cas)能够切断外源性的核酸，并能够由两种小分子RNA将其定向到其靶基因序列上[2]。据报道cas蛋白家族已经超过40多种，基于Cas蛋白的序列和结构，CRISPR/Cas系统主要分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3种类型[3，4]。Ⅱ型CRISPR/Cas系统仅需要单个Cas蛋白Cas9，其含有HNH核酸酶结构域和RUVC样核酸酶结构域[5]。该系统由两部分组成——tracrRNA和crRNA，两部分融合表达之后，形成一个具有引导功能的小向导RNA(small guide RNA, sgRNA)。sgRNA的5′端与目的DNA的20个核苷酸特异性结合，3′ 端可以结合核酸内切酶Cas9并将其激活，引导Cas9对目的DNA进行精确切割[6]。该技术因能更有效、更便捷地编辑基因而被广泛应用。

酵母沉默信息调节蛋白2(silent information regulators2, SIRT2)，是一个高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nieotinamide adenie diueleotide, NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase, HDAC)和ADP核糖基转移酶[7]。哺乳动物的sirtuins蛋白有7类，分别为SIRT1～SIRT7，它们具有高度保守的NAD+结合域和催化功能域，不同的N端和C端使具有不同的底物特异性和亚细胞定位[8～10]。该家族成员参与基因沉默、新陈代谢、组蛋去乙酰化、细胞周期调节和抗衰老等多项生物学过程[11]。SIRT2最初作为微管蛋白的去乙酰化酶被认识，进一步的研究表明，SIRT2可以去乙酰化很多重要的转录因子和调节蛋白，从而调控多种生物学过程[7，12]。SIRT2还可以对组蛋白进行修饰、使其去乙酰化，在细胞周期的有丝分裂过程中，SIRT2从细胞质进入细胞核并与染色质发生共定位。

本研究利用慢病毒结合CRISPR/Cas9技术将HEK293细胞中的SIRT2基因敲除，建立SIRT2稳定敲除的细胞系，为深入研究SIRT2对组蛋白的修饰功能提供基础。……