溶解氧变化对中华乌塘鳢酶活的影响及其低氧耐受力研究

马粒雅 王闻 迟雯丹

摘要 将中华乌塘鳢置于密闭的玻璃容器中，在溶解氧浓度分别为3.5、1.0、0.5、0.3、0.05、0、0 mg/L（将鱼憋2 h后）时分别进行取样，测定肝脏、肠和鳃中的酶活。结果表明，中华乌塘鳢肝脏组织中的抗氧化酶活性最高，肠组织中免疫酶活性最高，而外周组织（鳃）的酶活性远低于其他组织;当溶解氧浓度降至约0.31 mg/L时，抗氧化酶和免疫酶活性均明显下降，这可能是中华乌塘鳢进入了一種类似休眠的状态，整个新陈代谢降低仅能维持基本的生命状态;当水中溶解氧几乎消耗完全时，中华乌塘鳢为维持其基本生命特征而进行自身调节，抗氧化酶和免疫酶的活性又出现明显升高。

关键词 中华乌塘鳢;溶解氧;碱性磷酸酶;超氧化歧化酶;过氧化氢酶

中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0091-04

Abstract Chinese black sleepers were cultured in closed glass vessels，and samples were collected when the concentration of dissolved oxygen was 3.5， 1.0， 0.5， 0.3， 0.05， 0 and 0 mg/L（dissolved oxygen disappeared for 2 hours）.The enzyme activities in the liver， intestine and gill were determined. The results showed that the activity of antioxidant enzymes was the highest in the liver and the activity of immune enzymes were most active in intestinal tissues， while both of them were much lower in the gill than that in the liver and intestinal tissues. When the dissolved oxygen concentration dropped to 0.31 mg/L，the activities of antioxidant enzymes and immune enzymes decreased significantly， this might be caused by the fact that Chinese black sleepers entered a state similar to dormancy， so that the entire metabolism was reduced only to maintain the basic state of life. However， when dissolved oxygen in water was almost consumed completely， the activities of antioxidant enzymes and immune enzymes increased again， which might be derived from the selfregulation of Chinese black sleepers to maintain its basic life characteristics.

Key words Chinese black sleeper;Dissolved oxygen;Alkaline phosphatase（AKP）;Superoxide dismutase（SOD）;Catalase（CAT）

中华乌塘鳢隶属塘鳢科乌塘鳢属，广泛分布于我国黄海南部，东海，南海以及日本海域[1]。中华乌塘鳢是一种低氧耐受性很强的鱼类，通过对其在不同溶解氧浓度下碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性的研究来揭示其耐低氧能力[2]。它的存活率很高，能很快将伤口愈合并维持健康的生命体征。另外，中华乌塘鳢的最大特点是对低氧和干露的耐受性很强，即使只在离水的阴湿环境中也能生存7 d左右[3]，是一种能够适应当前海洋生态环境变化的优良品种。目前对中华乌塘鳢的研究主要集中在繁殖、养殖方面，而对该种鱼在低溶解氧条件下的存活机理迄今尚未见报道。

当鱼类受到外界环境因素的影响时，激发非特异性免疫系统是机体用来抵抗外界环境的主要方式。磷酸酶是一类非特异性免疫酶，其活力是衡量免疫功能和机体状态的指标，反映了机体对外界环境的防御能力[4]。碱性磷酸酶（AKP）是其中重要的一种机体功能调节酶，通过促进营养的转运和吸收来加强机体的非特异性免疫能力[5]。当鱼类受到环境胁迫时，碱性磷酸酶活性被激发以抵抗外界条件对自身的影响。目前已有研究表明环境条件（如水温[6-7]、盐度[8-9]、溶解氧[10-11]、重金属[12-13]、有机污染物[14-15]等）的变化能引起鱼体内碱性磷酸酶活性的变化，产生应激反应。

鱼类在水体中不同环境下的生命体征也可以用抗氧化酶活力来反映，从而判定鱼类是否受到外界环境的胁迫。超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内一种重要的抗氧化酶，主要通过催化歧化作用将过氧化物自由基转化为过氧化氢（H2O2）和氧（O2），将生物体内有害的活性氧清除[16]。过氧化氢酶（CAT）通过催化分解作用将过氧化氢歧化分解为水（H2O）和氧气（O2），防止细胞受到过氧化氢的毒害作用，为机体提供抗氧化防御能力[7]。目前国内外关于鱼体内抗氧化酶活性受温度[17-20]、盐度[18-20]、溶解氧[21-22]等环境条件胁迫而发生变化的研究很多，但关于中华乌塘鳢的研究却尚未报道。

笔者通过对低氧状态下中华乌塘鳢不同组织内免疫酶和抗氧化酶活性的测定，探究低氧胁迫下中华乌塘鳢不同组织酶活性的差异及低氧条件对酶活性的影响，旨在初步探究中华乌塘鳢的耐低氧机制，为中华乌塘鳢的人工养殖和运输提供一定的理论基础，同时为实现其他生物在低氧条件下的存活提供研究方向。

1 材料与方法

1.1 试验鱼来源和试验用水

试验用鱼为广西海域直接捕捞的样品鱼，选取生命体征良好、平均体重（74.45±13.95）g、平均体长（17.55±1.25）cm的健康中华乌塘鳢进行试验。

试验用水为经沉淀和砂滤的天然海水，盐度为25%～27%，pH为8.1～8.2[8]。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计。

试验采用密封玻璃容器作为呼吸室进行中华乌塘鳢的耗氧试验，基于非侵入式光学氧传感器进行溶解氧测定，将溶氧膜固定于玻璃容器内壁中间位置，注满海水放入试验鱼进行测定，以保持室温25 ℃和密闭条件。

试验设置8个组，Ⅰ组为对照组，只加满海水不放入试验鱼;Ⅱ～Ⅷ组加满海水分别放入10条鱼，Ⅱ～Ⅷ组溶解氧浓度在鱼的呼吸作用下随时间而明显下降，使用溶解氧测定仪（非侵入式光学氧传感器，规格为PreSens Microx 4）每隔1 min对试验容器内海水的溶解氧进行测定（海水的初始溶解氧浓度为6.0 mg/L），当溶解氧浓度降至约3.5、1.0、0.5、0.3、0.05、0、0 mg/L（溶解氧浓度降至0 mg/L后2 h）时分别进行取样，在冰上进行无菌解剖，取肝脏、肠、鳃3种组织装入冷存管中并按顺序编号用液氮冷冻保藏，分别对3种组织的碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）进行酶活测定。

1.2.2 酶活性测定方法。

将冷冻的组织准确称重，按质量体积比1∶9（g∶mL）加入定量生理盐水在冰浴条件下配制成10%的组织匀浆，并保持4 ℃温度，以2 500 r/min的转速离心10 min，取上清液以供测定酶活性。酶活均使用南京建成生物有限公司试剂盒进行测定，按照说明书进行操作。

碱性磷酸酶（AKP）的活力单位定义为1 g组织蛋白在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位，然后再将金氏单位换算成国标。

超氧化物歧化酶（SOD）的活力单位定义为1 mg组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为1个酶活力单位[11]。

过氧化酶（CAT）的活力单位定义为1 mg组织蛋白1 s分解1 mol的过氧化氢（H2O2）的量为1个酶活力单位[12]。

1.3 数据处理

使用Microsoft Excel 2013和SPSS 16.0统计软件进行数据处理和分析，结果均以平均值±标准误（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 中华乌塘鳢耗氧率测定

将中华乌塘鳢置于密闭的容器中，对其耗氧率进行测定。从图1可以看出，在2 h内，中华乌塘鳢的耗氧率从最初的0.2 mg/（h·g）降低至002 mg/（h·g）。随着溶解氧浓度的进一步降低，中华乌塘鳢表现出明显的活力降低，仅有鳃和鳍微动，其耗氧率也缓慢下降，接近于零。持续4 h后，耗氧率降至零（容器内海水溶解氧浓度为0 mg/L），中华乌塘鳢仍能在这种状态下存活4 h左右。

2.2 低氧胁迫下不同组织AKP活性的变化

对中华乌塘鳢不同组织中的AKP活性进行测定，观察发现在低氧状态下肝脏组织中AKP活性为10～20 U/mg，肠组织中AKP活力为400～1 200 U/mg，鳃中AKP活性为9～12 U/mg。从图2可以看出，肠组织中AKP活性远高于肝脏和鳃，而肝脏中AKP活性略高于鳃。这表明肠组织是中华乌塘鳢体内AKP酶的主要分布区，在溶解氧较低的状态下肠组织受到影响，会分泌更多的AKP以适应环境的变化。

因为中华乌塘鳢体内不同组织所含AKP活性的差异较大，分别对肝脏、肠和鳃中溶解氧浓度对AKP活性的影响进行分析。从图2可以看出，随着溶解氧浓度的逐渐降低，肝脏和肠中AKP活性基本不发生变化。当溶解氧浓度进一步降低时，AKP活性开始上升;溶解氧濃度达到0.31 mg/L时，AKP活性出现峰值随后开始下降（P>005）;当溶解氧浓度达到0.05 mg/L时，AKP活性再次升高（P>0.05）。鳃中AKP活性也随着溶解氧浓度的降低呈现先上升后下降的趋势，但变化范围并不大，且各试验组间无显著差异（P>005）。

2.3 低氧胁迫下不同组织抗氧化酶活性的变化

对中华乌塘鳢不同组织中SOD和CAT活性分别进行测定，发现低氧状态下肝脏组织中SOD活性为550～750 U/mg，肠组织中SOD活性为170～200 U/mg，鳃中SOD活性为50～75 U/mg（图3）。从图3可以看出，SOD活性在肝脏、肠和鳃中从高到低依次为肝脏、肠、鳃，且肝脏中SOD活性远高于其他组织。CAT活性在中华乌塘鳢体内各组织中的分布比例与SOD活性相似，其活性分别为肝脏35～55 U/mg，肠组织2～5 U/mg以及鳃组织0.4～0.8 U/mg（图4）。这表明抗氧化酶分布在中华乌塘鳢体内的不同组织中，但肝脏所占的比重较大，且SOD活性相较于CAT活性高得多。

图3呈现出肝脏、肠和鳃组织中SOD活性随着溶解氧浓度下降的变化趋势。肝脏和肠组织中SOD活性的变化趋势与AKP活性相似，SOD活性先不随溶解氧浓度而变化，当溶解氧浓度达到1.04 mg/L时SOD活性开始上升，达到峰值时开始呈下降趋势，最终当溶解氧浓度几乎为0 mg/L时，SOD活性又逐渐增大（P>0.05）。鳃中的SOD活性随溶解氧浓度的下降呈上升下降交替变化的趋势，当溶解氧浓度下降为005 mg/L时，SOD活性不再下降而呈现明显的上升趋势（P>0.05）。

图4分别显示出肝脏、肠和鳃组织中CAT活性随着溶解氧浓度下降的变化趋势。肝脏和肠中CAT活性随着溶解氧浓度的降低而呈现出先升高后下降的趋势，且各试验组间无显著差异（P>0.05），当溶解氧完全耗尽时，试验鱼体内CAT活性开始上升（P>0.05）。鳃中CAT的活性始终保持在0.5 U/mg左右，几乎不随溶解氧浓度的变化而发生变化（P>0.05）。

3 讨论

3.1 低氧胁迫对不同组织AKP活性的影响

鱼类在整个生存过程中主要依靠非特异性免疫系统抵抗外界条件的影响。AKP作为生物体内第四道防线中非常重要的非特异性免疫酶之一，其活力是鱼类自身免疫系统的重要指标[23]。该研究发现在中华乌塘鳢肝脏、肠和鳃组织中肠组织的AKP活性较高，且受氧浓度的影响较大，而肝脏的AKP活性略高于鳃。依据相关文献报道，肠组织与营养物质消化、吸收和转运有着密切关系[24-25]，这与AKP的作用相适配，因此在中华乌塘鳢肠内AKP活性较高。肝脏是生物体内主要的解毒器官，通过AKP的作用将有毒物质分解，以维持稳定状态[26-28]，因此肝脏中也存在一定量的AKP。鳃主要具有呼吸、滤食和排泄等功能，并不是鱼类的免疫器官，因此AKP的活性较小。

当溶解氧浓度大于0.45 mg/L时，中华乌塘鳢的生命体征良好，体内的免疫性酶不受溶解氧变化的影响而保持稳定状态。随着溶解氧浓度的进一步下降，中华乌塘鳢做出应激反应，通过提高AKP的活性来加强自身的非特异性免疫能力。当溶解氧浓度达到0.31 mg/L时，中华乌塘鳢为了维持基本生命体征而降低自身新陈代谢水平，使机体进入近似休眠状态，AKP活性也随之下降。当溶解氧浓度下降至0.05 mg/L时，试验鱼呼吸受阻，生命体征出现异常，抗氧化酶通过将体内的自由基转换，以得到更多的氧气维持呼吸，而转化过程中产生的有毒有害物质可以被AKP降解，因此AKP的活性升高。

3.2 低氧胁迫对不同组织抗氧化酶活性的影响

与其他有氧生物一样，鱼体内具有完善的抗氧化防御系统，以抵抗正常新陈代谢活动时产生的对身体有害的活性氧物質[29]。SOD和CAT是抗氧化酶系统的重要组成部分，对于维持体内自由基平衡有重要的作用[30]。肝脏是生物体内新陈代谢和氧气消耗的主要组织，肝脏中SOD通过歧化作用将过氧化物自由基转化为过氧化氢（H2O2）和氧气（O2）以在低氧状态下维持生命，而CAT可将转化产物过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2），在得到生命所需氧气的同时将过氧化氢分解，以提高自身抗氧化能力。抗氧化酶分布在中华乌塘鳢体内的不同组织中，但肝脏所占的比重较大，且SOD的活性相较于CAT活性高得多。

当溶解氧浓度大于0.45 mg/L时，中华乌塘鳢体内抗氧化防御系统相关的SOD和CAT通过自身的活性调节来维持体内自由基的平衡，并未随着溶解氧的降低有明显变化。当溶解氧浓度进一步下降时，中华乌塘鳢开始出现应激反应通过提高抗氧化酶活性来加强机体抗氧化能力，维持生命体征的正常。当溶解氧浓度降低至0.31 mg/L时，抗氧化酶活性降低，中华乌塘鳢表现出明显的活力减少，仅有鳃和鳍微动，整体新陈代谢水平下降。当溶解氧浓度基本耗尽时，试验鱼无法吸收水中的氧进行呼吸，只能通过调节抗氧化酶活性来促进氧化自由基的分解生成氧气，以供自身呼吸。

该研究通过对中华乌塘鳢在低氧条件下耗氧率及不同组织中免疫酶和抗氧化酶活性变化进行分析，观察发现中华乌塘鳢在溶解氧浓度开始下降的过程中耗氧率快速下降，免疫酶和抗氧化酶的活性有明显的上升趋势;然而，当溶解氧浓度降至0.31 mg/L时，中华乌塘鳢活力明显降低。为了维持其生命特征，整个机体的新陈代谢水平开始下降，导致免疫酶和抗氧化酶下降。随着氧气的进一步消耗，中华乌塘鳢的耗氧率降为0 mg/（h·g），免疫活性酶和抗氧化活性酶的活性明显升高，使其仍能在这种状态下维持4 h左右。初步认为中华乌塘鳢的耐氧机制大约在溶解氧浓度为0.31 mg/L时开始启动，通过降低自身的新陈代谢水平维持生命特征，使机体处于近似于休眠状态。当水中溶解氧几乎为零时，为了维持机体基本的生命特征，体内的酶又重新被激活，肝脏中抗氧化酶通过分解体内氧化自由基来维持生命，同时免疫酶将产生的有毒有害物质转运，并在肠组织中通过免疫酶的作用将其降解吸收。

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