高产黄原胶基因工程菌发酵条件优化研究

马建荣 黎敬鸿 余永红

摘要 采用控制变量的方法对高产黄原胶基因工程菌的发酵条件进行优化研究。通过改变发酵相关碳源、氮源、接种量、时间等培养条件进行分析得到发酵的最优条件。经过试验确定，在含有5 g细菌蛋白胨，3 g酵母提取物，20 g甘油，6%蔗糖，加去离子水至1 L，调pH至7.0所配制的培养基下，以接种量为0.5%接种突变菌XccYH1，30 ℃培养4 d，发酵所得的黄原胶产量最多。

关键词 野油菜黄单胞菌;黄原胶;发酵;优化

中图分类号 TQ920.6 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）03-0175-03

Abstract To optimize the fermentation condition of highyield xanthan gum genetic engineering bacteria by controlling variable methods.Changing the culture conditions such as fermentationrelated carbon source，nitrogen source，inoculation amount and culture time to obtain the optimum fermentation conditions.It has been experimentally determined to be inoculated in a medium containing 5 g of bacterial peptone，3 g of yeast extract，20 g of glycerol，6% of glucose，added deionized water to 1 L，and adjusted pH to 7.0.The 0.5% of mutant XccYH1 was cultured at 30 ℃ for 4 days，the yield of xanthan gum obtained by fermentation was the most.

Key words Xanthomonas campestris;Xanthan gum;Fermentation;Optimization

单胞菌属（Xanthomnas）是植物病原菌中较大的类群，能侵染400多种植物，包括许多重要的农作物和经济作物[1]，如水稻（白叶枯病，X.oryzae pv.oryzae）[2]、棉花（角斑病，X.axonopodis pv.malvacearum）[3]、十字花科植物（黑腐病，X.campestris pv.campestris，以下简称Xcc）[4]、柑橘（溃疡病，X.axonopodis pv.citri）[5]等，侵染后影响农作物和经济作物的产量和品质，造成严重的经济损失[6]。

Xcc是研究病原菌与寄主植物相互作用的模式菌株，其侵染寄主植物过程中，产生多种致病因子，包括胞外多糖（EPS）、脂多糖、胞外酶（果胶酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等）以及黏附素等[7]。Xcc分泌的胞外多糖，又称为黄原胶。虽然黄原胶是黄单胞菌的致病因子，但在其他领域却具有重要应用价值[8]。黄原胶是当前国内外已经开发的几种微生物多糖中最具有特色的一种，也是世界上生产规模最大、用途最广的微生物多糖。目前，全世界黄原胶的年产量已超过20万吨，在发酵工业中占重要地位，也为相关行业带来了巨大的经济效益[8]。其常作为助悬剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂等，在医药、食品、饮料、化妆品、洗涤剂、涂料、石油开采等领域中被广泛应用[9-10]。

但我国黄原胶发酵产量有待提高，随着Xcc全基因组测序完成，黄原胶合成相关的代谢途径和分子机制已经研究清楚，为分子生物学手段定向改造提供了可能[11]。获得黄原胶高产基因工程菌株，优化发酵的相关条件，发展我國黄原胶发酵的生产力是一种切实可行的方法[12]。

前期对黄原胶合成基因簇下游基因Xc_1672进行敲除，检测发现突变株XccYH1显著提高了黄原胶产量，具有较好的工业应用前景。该研究拟通过控制变量法探究黄原胶发酵的最优条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和试剂。

黄原胶高产菌株XccYH1由本实验室通过基因工程方法获得。抗生素利福平购自Sigma公司。

1.1.2 仪器。

PB-10 pH计（SARTORIUS AG）;MP2002电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）;DHP-9052型电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;SW-CJ-2FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）;ZHWY200B恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）;LS-B50L-Ⅱ立式压力蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备有限公司）;QL-902漩涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;DHG-9240鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 野油菜黄单胞菌胞外多糖的检测。

将菌株XccYH1接种于NYG液体培养基（5 g/L蛋白胨，3 g/L酵母粉，20 g/L甘油）中，30 ℃（200 r/min）摇床培养24 h后，调整菌体浓度至OD600约为1.0，并按1%的比例接种至含4%碳源的NYG中（含相应抗生素），30 ℃ （200 r/min）摇床培养5 d后，加入4倍体积的无水乙醇沉淀胞外多糖，边注入边搅拌，然后将絮状沉淀物取出后置于42 ℃充分干燥，所得即为黄原胶。以黄原胶重量作为衡量发酵效果的标准。

1.2.2 碳源对黄原胶发酵的影响。

以淀粉、葡萄糖、麦芽糖和蔗糖作为培养基碳源，考察碳源对黄原胶发酵的影响。在NYG中加入4%淀粉、4%葡萄糖、4%麦芽糖和4% 蔗糖作为培养基，按照“1.2.1”方法进行黄原胶发酵，每组发酵设计平行做3个。

1.2.3 碳源浓度对黄原胶发酵的试验。以上一步试验所得最佳碳源作为培养基的碳源，考察碳源浓度对黄原胶发酵的影响。在NYG中加入2%、4%、6%和8%最佳碳源作为培养基，按照“1.2.1”方法进行黄原胶发酵，每组发酵设计平行做3个。

1.2.4 氮源对黄原胶发酵的影响。

以蛋白胨、细菌蛋白胨和牛肉浸取物作为培养基的氮源，考察氮源对黄原胶发酵的影响。将NYG培养基中的蛋白胨改变成蛋白胨、细菌蛋白胨和牛肉浸取物，按照“1.2.1”方法进行黄原胶发酵，每组发酵设计平行做3个。

1.2.5 发酵时间对黄原胶发酵的影响。

按照“1.2.1”方法进行黄原胶发酵，并在接种后2、3、4、5 d进行收集测量，每组发酵设计平行做3个。

1.2.6 接菌量对黄原胶发酵的影响。

分别在培养基中加入0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的菌体，按照“1.2.1”方法进行黄原胶发酵，每组发酵设计平行做3个。

1.2.7 菌种稳定性对黄原胶发酵的影响。

将XccYH1划线接种到NYG培养基中进行培养，标记为1代。每隔1 d重新接菌到平板上，直到接菌至10代。选取1代、4代、7代、10代菌株进行黄原胶发酵。按照“1.2.1”方法进行黄原胶发酵，每组发酵设计平行做3个。

2 结果与分析

2.1 碳源对黄原胶发酵产量的影响

为进一步提高基因工程菌XccYH1的黄原胶产量，首先探索不同碳源对黄原胶产量的影响。由图1可知，以淀粉、葡萄糖和麦芽糖为碳源时，黄原胶产量无显著性差异，而以蔗糖为碳源时，所产的黄原胶产量最高，后续试验中以蔗糖作为碳源测定黄原胶产量。

2.2 碳源濃度对黄原胶发酵产量的影响

进一步考察添加不同浓度碳源时，基因工程菌黄原胶的产量变化。由图2可知，在低浓度碳源（2%～6%）时，黄原胶产量随着浓度的增加而显著增加，当添加6%蔗糖时黄原胶产量最高，达20.3 g/L。但继续提高碳源浓度到8%，显著抑制菌体生长，也没有检测到黄原胶。因此，碳源浓度为6%时，黄原胶产量最高。

2.3 氮源对黄原胶发酵产量的影响

由图3可知，在实验室常用的氮源中，细菌蛋白胨的效果最好，所产黄原胶产量最高，而以牛肉浸取物为氮源时，黄原胶产量最低。因此，检测条件下，细菌蛋白胨为最优氮源。

2.4 发酵时间对黄原胶发酵产量的影响

在工业生产中，发酵时间长短对生产成本有重要影响。为探索基因工程菌XccYH1的最佳发酵时间，该研究测定了第2～5天所产生黄原胶的产量（图4），结果显示4～5天发酵产生的黄原胶产量相当，无显著性差异，但第3天产生的黄原胶约为第4天产量的92%，而第2天产量仅为第4天产量的74%，发酵第1天没有检测到黄原胶的产生。以上结果说明，该基因工程菌的最佳发酵时间为4 d，而这一特点与野生菌没有差异。

2.5 接菌量对黄原胶发酵产量的影响

接种量直接影响种子液的培养成本，同时也能直接影响菌体生长延滞期时长，直接影响工业生产成本，该研究继续探索了不同接种量对黄原胶产量的影响（图5），结果显示接种量为0.5%～4.0%时，发酵产生的黄原胶产量无明显差异，推测其原因可能是该基因工程菌生长与野生菌无明显差异，在发酵条件下24 h内都能生长到平台期，不影响黄原胶的合成。

2.6 基因工程黄原胶高产菌的稳定性研究

基因工程菌的稳定性往往是能否进入工业化应用的重要评价指标，在非抗生素压力条件下稳定性好的菌种将具有更好的应用前景，该研究将XccYH1菌株在无抗性的培养基上连续划线传10代后，菌落形态没有差异，进一步考察了传不同代数时黄原胶的产量（图6）。结果显示，该菌株产黄原胶能力没有明显改变，第4代菌株的黄原胶产量为第1代菌株的98%，第7代为95%，第10代菌株的黄原胶产量仍有94%。以上结果说明，基因工程菌XccYH1菌株具有非常好的稳定性，可以满足工业生产需求。

3 结论与讨论

野油菜黄单胞菌（Xcc）是十字花科植物黑腐病菌的病原菌，在全球范围内引起植物病害，造成重大的经济损失。Xcc在植物侵染过程中产生众多的致病因子，包括蛋白酶、纤维素酶、胞外多糖等，因此Xcc也是研究细菌与植物互作的模式菌种[2]。另一方面，Xcc产生的胞外多糖（黄原胶）又具有重要的工业价值，在食品、药品、化妆品等诸多领域中有广泛的应用。

该研究利用控制变量法，探究在不同碳源、不同碳源浓度、不同氮源、不同发酵时间、不同接种量发酵条件下，基因工程菌的黄原胶产量差异，结果表明黄原胶发酵的最佳碳源是蔗糖，最佳碳源浓度是6%，最佳氮源为细菌蛋白胨，最佳培养时间为4 d，接种量对发酵没有显著性影响。

该研究还探索了基因工程菌黄原胶产量的稳定性，结果显示在无抗生素选择压力时，该基因工程菌的稳定性较好，第10代菌株的黄原胶产量仍有第1代菌株的94%，说明该菌株能满足工业生产的要求。黄原胶是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸等组成的酸性杂多糖，碳源对黄原胶产量的影响非常显著[13]。该研究也发现在低浓度时，黄原胶产量随着碳源浓度增加而显著提高，但当蔗糖浓度增加到8%时，菌株不能生长，推测是因为蔗糖浓度过高以致渗透压过大，反而有了抑菌效果。该研究对基因工程菌进行了发酵条件的初步优化，为该菌株的工业化开发奠定了基础。

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