基于网络药理学与分子对接方法探析六磨汤治疗便秘的机制研究

吴春凤 杨文娜 郑景辉 刘春强 黄业保 张岚

【摘 要】 目的：利用网络药理学和分子对接方法探究六磨汤治疗便秘的有效成分、作用靶点和通路信息。方法：依托TCMSP数据库筛选出六磨汤有效化合物及其作用靶标，基于CTD数据库和Genecards数据库检索便秘的相关靶标，将两者进行比对得到六磨汤对便秘的作用靶标，再对作用靶标进行拓扑分析筛选出关键靶点，并利用生物学手段分析关键靶点参与的生物学过程和通路，最后用分子对接方法将化合物和作用靶标进行对接，验证化合物进入体内后能否与靶点稳定结合。结果：利用数据库筛选得到43个六磨汤的有效活性成分和116个作用靶点，与便秘发病机制相关的作用靶点54个，经过拓扑分析得到17个关键治疗靶点，这些作用靶点参与机体的细胞代谢、脂多糖的反应、蛋白的磷酸化、细胞对机械刺激的反应等，富集80条信号通路，包括直肠癌信号通路、PI3K信号通路、CAMP信号通路等。分子对接结果显示六磨汤的有效成分与作用靶点结合性良好。结论：六磨汤具有多成分、多靶点，通过这些活性成分和作用靶点多途径调节肠道收缩节律和肠道功能治疗便秘。

【关键词】 网络药理学;分子对接;六磨汤;便秘;生物学过程

【中图分类号】R285   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2020）21-0035-10

Abstract：Objective To explore the effective components， targets and pathway information of Liumo Decoction in the treatment of constipation by means of network pharmacology and molecular docking. Methods Based on TCMSP database， the effective compounds and their targets of Liumo Decoction were screened. The constipation related targets were retrieved based on CTD database and Genecards database. The constipation targets of Liumo Decoction were obtained by comparing the two databases. The key targets were screened by topological analysis， and the biological processes and connections of the key targets were analyzed by biological means. Finally， we use molecular docking method to dock the compound with the target to verify whether the compound can stably bind to the target after entering the body. Results 43 active ingredients and 116 targets of Liumo Decoction were screened from the database. 54 targets were related to the pathogenesis of constipation. 17 key therapeutic targets were obtained by topological analysis. These targets were involved in cell metabolism， lipopolysaccharide response， protein phosphorylation， cell response to mechanical stimulation， and enriched 80 signaling pathways. Including rectal cancer signaling pathway， PI3K signaling pathway， CAMP signaling pathway and so on. Molecular docking results showed that the effective ingredients of Liumo Decoction had good binding with the target. Conclusion Liumo Decoction has many components and targets， which regulate intestinal contraction rhythm and intestinal function to treat constipation.

Keywords：Network Pharmacology; Molecular Docking; Liumo Decoction; Constipation; Biological Process

便秘（Constipation）是臨床上常见的功能性胃肠道疾病，主要表现为大便干结、排出困难及排便频率减少[1]。随着生活节奏的日益加快与工作压力的增加，便秘的患病率逐年上升。据流行病学调查显示，全世界成人慢性便秘发病率在2.5%～79%之间[2]，而我国慢性便秘的发病率约为6%[3]。目前便秘的西医治疗主要以各类泻剂为主，疗效欠佳。长期便秘可引起肛肠疾病，加速老年痴呆，严重时诱发心脑血管意外等疾病，甚至导致猝死[4]。中医认为便秘是大肠传导功能失司的主要表现之一，根据其不同发病的病因病机进行多层次、多角度的辨证施治，取得确切的临床疗效，并且在基础的中药药理实验研究中积累了丰富的经验。

六磨汤出自元代名医危亦林所著的《世医得效方》卷六，由槟榔、沉香、木香、乌药、大黄、枳壳各等分组成，具有调肝理脾、通便导滞的作用，尤其适用于气机郁滞、大肠传导失职之便秘。现代药理研究表明[5]，六磨汤可以促进消化液分泌，增强胃肠蠕动和肠肌张力，使胃肠收缩节律增强，对抗肠肌痉挛，对胃肠平滑肌有兴奋和抑制双向调节作用，抑制肠内水分吸收，调节肠道功能，增加粪便的体积，使粪便软化，使肠道运转时间正常，从而促进排便，较好地解决了排便困难的问题。

中医药具有“多靶点、多途径、多环节”干预疾病的特点，传统的药理学研究不能系统的阐述中医药治疗疾病的具体作用机制，网络药理学是基于生物信息学、分子生物学及各大数据库信息系统地研究“药物-靶点-通路-疾病”之间的相互作用，将当前的“一靶一药”模式的研究模式更新为新的“网络靶多组分”模式，其观念与中医药整体观、辨证论治的原则一致[6]。本研究利用网络药理学与分子对接方法，从“药物-化合物-作用靶点-疾病”复杂网状结构探究六磨汤治疗便秘的关键作用靶点、分子生物学过程、信号通路等，以期为六磨汤的基础研究提供参考思路。

1 材料与方法

1.1 六磨汤有效化合物及其作用靶标的筛选 中药系统药理学平台（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology Platform，TCMSP）是融合了药物化学、药代动力学、网络靶点预测等网络信息的中药系统、药理学数据库和分析平台，该数据库收录了近500个已经在中国药典注册过了的草药，囊括了超过31000种化学成分，其中药化学库较准确全面[7]。研究利用TCMSP数据库，根据药物分子的ADME性质以口服生物利用度OB≥30%、类药性DL≥0.18为筛选条件，筛选出六磨汤的六味药槟榔、沉香、木香、乌药、大黄和枳壳的有效化合物和对应的化合物靶标。将化合物靶标蛋白逐一输入UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）检索以剔除重复、非人源靶点，并转化为活性化合物规范的靶点蛋白的基因标识符（Gene Symbol）。

1.2 便秘相关发病机制靶点的预测 GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库提供所有有关注释和预测人类基因的信息，它自动整合来自约150个网络来源的以基因为中心的数据，包括基因组、转录组学、蛋白质组学、遗传、临床和功能信息。CTD（http：//ctdbase.org/）数据库是个提供有关化学-基因/蛋白质相互作用、化学-疾病和基因-疾病关系的人工整理信息的公开数据库，可以从该数据库里查看有关化学物质的各种信息，包括化学结构、相互作用基因和蛋白质、推断的疾病关系等。以“constipation”为检索词在GeneGards和CTD数据库中搜查与便秘相关发病机制靶点，根据数据库的默认排序，各取前300个靶点，去掉重复的靶点，收集整合得到便秘相关发病机制靶点。

1.3 六磨汤对便秘的潜在治疗靶点的收集及靶点的拓扑分析 将1.1得到的化合物靶点和1.2收集到的疾病靶点导入Venny 2.1.0（http：//bioinfo gp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线分析工具，得到交集靶点。STRING 10.5（https：//string-db. org）数据库是一个储存已知的和预测的蛋白质相互作用的数据库，其包含蛋白间直接的和间接的相互作用。观察这些作用靶点蛋白之间的交互作用关系，将交集靶点导入STRING数据库，将Organism设定为“Homo aspiens”，最小交互分数取0.4，得到蛋白互作信息。由于STRING数据库无法直观的表现靶蛋白的Degree变化，故将STRING的蛋白互作信息保存为TSV格式并导入Cytoscape 3.6.1软件软件中进行可视化分析，在软件中设置节点大小与颜色反映Degree大小变化，节点越大、颜色越深Degree越大，边的粗细反映Combined score大小变化，Combined score值越大边越粗，构建PPI网络。并利用Network Analyzer功能进行拓扑属性分析，取度值和介数均超过平均值的靶标，认为这些靶标是关键靶点。

1.4 关键靶点的GO分析和KEGG分析 DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）是一个生物信息数据库，整合了生物学数据和分析工具，为大规模的基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息，帮助用户从中提取生物学信息。将1.3筛选出来的度值和介数均大于平均值的靶点即关键靶点，输入DAVID数据库进行GO分析和KEGG分析。

1.5 活性成分与靶蛋白的分子对接 分子对接能有效地确定与靶受体活性部位空间和电性特征相匹配的小分子化合物，进而确定化合物进入体内后能否与靶点结合发挥作用[8]。IGEMDOCK是款开源性的分子对接软件，一般用于活性筛选和快速对接，利用TCMSP数据库查找靶蛋白对应的活性成分，下载保存为mol 2格式，从Uniport数据库中找到潜在靶点的蛋白信息，保存为pdb格式，将靶蛋白数据信息和其对应的活性成分信息导入IGEMDICK软件进行分子对接。SystemsDock（http：//systemsdock.unit.oist.jp）是一个基于网络药理学的预测和分析的Web服务器，它应用高精度对接模拟和分子路径图来全面描述配体选择性，并说明配体如何作用于复杂的分子网络，故同时利用在线分子对接服务器SystemsDock进行分子对接。

2 结果

2.1 六磨汤有效化合物的收集 通过TCMSP数据库搜集到木香有106个化合物、枳壳17个化合物、大黄92个化合物、槟榔52个化合物、乌药128个化合物，根据“OB≥30%、DL≥0.18”筛选后，槟榔有8個有效化合物，木香6个，枳壳5个，大黄16个，乌药9个。TCMSP数据库未收录沉香的化合物，研究利用Batman-tcm数据库搜索沉香的化合物，得到50个化合物，由于batman-tcm提供的化合物没有OB、DL等参考值，故将这50个化合物重新输入TCMSP数据库筛选，最后有2个化合物符合筛选标准。这六味药共有46个有效化合物，其中木香和乌药共同有sitosterol这个化合物，枳壳、大黄和乌药共同拥有beta-sitosterol这个化合物，故去掉重复化合物后剩43个有效化合物，对应116个化合物靶点。详见表1。

2.2 便秘的相关疾病靶点与六磨汤治疗便秘的靶点的收集 以“constipation”为检索词在GeneGards和CTD數据库中搜查与便秘相关的靶点，GeneGards提供了2815个靶点，CTD数据库提供了19296个靶点，根据数据库的默认评分值，去重后各取前300个有代表性的靶点，和六磨汤筛选出来的靶点一同导入Venny 2.1在线分析工具得到交集靶点54个，认为这54个靶点是六磨汤治疗便秘的潜在作用靶点。如图1所示。

2.3 六磨汤治疗便秘的潜在作用靶点的PPI及靶点的拓扑分析 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）是指两个或两个以上蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体的过程，蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个重要组成部分。观察六磨汤治疗便秘的54个潜在治疗靶点这些靶蛋白间的关系网络，将54个靶蛋白导入STRING数据库，再经过Cytoscape软件进行可视化分析，结果如图2所示。蛋白交互作用值取中度0.4的时候，CHRM3和KCNH2与其他蛋白没有相互作用关系，该PPI网络中共有52个节点，拓扑分析发现平均节点度为22.7，介数中心性约为0.012，平均最短路径在1.1～2.1之间，网络中节点的连通度曲线、介数中心性曲线接近于幂律分布，并在关系网络中体现了较好的连通特性。其中度值和介数超过平均值的有17个靶点，分别是：AKT1、TP53、MAPK3、CASP3、JUN、FOS、MAPK8、MYC、CAT、MAPK1、VEGFA、PTGS2、CREB1、EGFR、ILB1、SOD1和PPARG，认为这17个靶点是六磨汤治疗便秘的关键作用靶点。详见图2、表2。

2.4 相关通路信息和注释分析 17个关键治疗靶点经David数据库GO分析得出186个生物学过程（Biological Process，BP），经过Bonferroni校正P值<0.05，得到158个生物学过程，包括药物反应（response to drug）、脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、凋亡过程的负调节（negative regulation of apoptotic process）、脂多糖介导的信号通路（lipopolysaccharide-mediated signaling pathway）、细胞对机械刺激的反应（cellular response to mechanical stimulus）等。这些关键治疗靶点涉及多种信号通路，取P<0.01，得到80条信号通路，包括结直肠癌信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、ErbB信号通路、Toll样受体信号通路等。如图3、图4所示。

2.5 分子对接验证 利用分子对接软件和系统分子对接服务器将六磨汤的17个关键治疗靶点与对应的化合物进行分子对接，IGEMDICK软件的分子对接结果是以能量的高低对化合物结合程度来判断的，能量越低，化合物分子与受体结合的作用可能性越大。系统分子对接结果一般认为Docking Score值大于4.25表示对接分子与靶点之间有一定的结合活性，大于5.0表明对接分子与靶点之间有较好的结合活性，大于7.0则说明具有强烈的结合活性，其中IL1B、EGFR、VEGFA、FOS、JUN和TP53由于没有受体，所以无法与化合物对接。对接结果显示分子对接得分大于5.0的有36个，大于7.0的有6个，结果见表3。表明六磨汤有效化合物进入机体后能与靶蛋白稳定结合，发挥治疗作用。

3 讨论

便秘是一种常见的、顽固的胃肠道疾病，严重影响着现代人们生活质量。研究表明[9]，便秘的发病受多种肠道动力与内分泌因素的影响。研究发现[10-12]，便秘的发病机制主要与胃肠动力障碍、脑-肠轴异常、神经递质异常、Cajal间质细胞异常、激素水平异常、肠道微生态失调、水通道蛋白异常、排便动力学异常等密切相关。六磨汤为临床上治疗便秘有效方，能够发挥调肝理脾、通便导滞的作用从而治疗便秘，对改善患者临床症状有明显的疗效，且副作用及并发症较少，但治疗的疗效机制尚未十分明确[13-14]。

研究利用网络药理学方法，通过数据库预测筛选出六磨汤的有效化合物43个，这些有效化合物包括橙皮素、槲皮素、川陈皮素、豆甾醇、大黄酸、大黄素等，这些有效化合物具有润肠通便、调节肠道菌群平衡、调节肠道动力等作用。如谭舒舒等[15]实验发现，枳壳中的橙皮苷能够在肠道中被肠道菌群水解成橙皮素，发挥促进小鼠小肠推进的作用，从而起到行滞消胀的功效。大黄酸是一种广泛存在于药用植物大黄的亲脂性蒽醌，是大黄起到泻下通便作用的主要有效成分[16]。现代药理实验研究发现，大黄蒽醌能够经过机体肠道菌群代谢后吸收后，调节血浆中胃动素，减少便秘小鼠结肠黏膜水通道蛋白的表达发挥通便的作用[17-19]。张晋蔚等[20]通过动物实验发现，槲皮素能够降低结肠黏膜水通道蛋白的表达，减少对肠道内容物水分的吸收，从而起到润肠通便，缓解慢性传输性便秘症状的作用。槟榔碱是槟榔的主要有效成分，能兴奋胆碱M3受体，具有兴奋全胃肠道平滑肌的作用，改善肠道动力从而治疗便秘[21]。本研究利用数据库分子反向对接预测出化合物的作用靶点，获得了有效化合物的作用靶点116个，将六磨汤的六味药、有效化合物及化合物的作用靶点进行合并，可知六磨汤6味中药含有多种化合物，每个化合物又有多个作用靶点，说明六磨汤具有多成分、多靶点的特点，共同协同，从多环节发挥治疗便秘的作用，如图5所示。通过对作用靶点的拓扑分析、GO分析和KEGG分析，可以发现六磨汤的有效化合物能作用于多个位点共同参与相关的生物学过程，进而改善便秘病症，如FOS，CASP3，PTGS2和JUN这4个靶蛋白作用于肠道对脂多糖的反应，AKT1，EGFR，CASP3，VEGFA，TP53，MAPK8，CAT，MYC共同调节细胞增殖和凋亡，富集的信号通路多样，如直肠癌信号通路、PI3K/AKT信号通路、Toll样受体信号通路、雌激素信号通路、CMAP信号通路等，便秘的相关机制研究涉及这些通路。研究表明，静脉注射血管活性肠肽（VIP）能调节大鼠肠道液代谢，进而改善便秘症状，可能与VIP-camp-pka-aqp3信号通路的调节有关[22]。杨筱[23]实验研究发现，通便汤能够有效治疗慢传输型便秘，其机制可能与其通过调节MAPK信号通路，抑制MAPKs的表达，从而减低AQP3、AQP4表达有关。通过分子对接方法将六磨汤的有效化合物与作用靶点进行对接，结果显示结合度良好，说明六磨汤有效成分能在机体稳定发挥治疗作用。

研究通过网络药理学与分子对接方法初步预测了六磨汤治疗便秘的作用机制，六磨汤通过合理的配伍，各种有效成分协同作用于调节肠道菌群平衡、诱导水通道蛋白的表达、细胞的代谢、蛋白磷酸化等各种生物学过程和MAPK、PI3K等不同的信号通路，发挥调节胃肠收缩、调节肠道功能、润肠通便等作用。本研究是基于大数据信息预测，具有一定的局限性，预测结果虽与当前的一些研究相契合，但后期仍需经过临床试验和动物实验验证，进一步揭示六磨汤治疗的机制，阐述中医行气导滞通便理论的科学内涵与中药调节效应的作用本质具有现实意义。

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（收稿日期：2020-06-09 编辑：程鹏飞）