基于新城疫病毒V蛋白鉴别鸡群感染与免疫的间接ELISA方法的建立

于得水，谢 鹏，梁健鹏，林秋燕，向 斌，徐成刚，廖 明，任 涛

（华南农业大学兽医学院，广州510642）

新城疫（newcastle disease，ND）是一种由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的鸡和多种禽类发病的急性、高度接触性传染病，给养禽业造成了巨大经济损失。我国目前主要通过疫苗免疫的方式对该病进行防控[1]。

NDV的基因组是单股、负链、不分节段的RNA，可分为6个基因片段，能够编码6种结构蛋白——NP、P、M、F、HN和L[2-3]。此外，P基因可通过RNA编辑机制使其mRNA编码框移码，翻译出另外两种非结构蛋白V和W[4]。研究表明，P基因转录的3种mRNA存在一定的比例，编码P蛋白、V蛋白和W蛋白的mRNA分别约占69%、29%和2%[5]。

结构蛋白是病毒粒子的组成成分，而非结构蛋白是病毒在细胞内复制时产生的一些辅助性蛋白，并不参与病毒粒子的装配[6-7]。常规灭活疫苗的抗原成分是失去感染能力的病毒粒子，无法利用细胞蛋白表达系统表达非结构蛋白，而野毒感染后会编码非结构蛋白以促进病毒复制，而非结构蛋白作为病毒抗原会进一步刺激机体产生特异性抗体[8-9]。基于灭活疫苗和野毒感染情况下V蛋白表达水平差异引起的V抗体水平差异，本研究选择通过间接ELISA方法检测NDV非结构蛋白V的抗体应答水平差异来区分NDV疫苗免疫与野毒感染。另外，由于V蛋白与P蛋白、W蛋白的N-端氨基酸序列相同，而C-端不同[10]，为了对V蛋白抗体进行特异性检测，排除P蛋白抗体的干扰，本研究选择V蛋白C-端结构域（Vc）作为ELISA包被抗原。

本研究利用原核表达系统表达重组蛋白Vc，以其为抗原建立间接ELISA方法。该方法可以通过检测血清中NDV V蛋白的抗体水平，进而区分NDV疫苗免疫与强毒感染。该方法为NDV血清学诊断和流行病学调查提供了一种新的检测手段，具有较好的应有前景。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 大肠杆菌BL21感受态细胞购自天根生化科技有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）His标签纯化填料购自GE公司；IPTG购自Genview公司；鸡新城疫灭活疫苗（La Sota株）购自普莱柯生物工程股份有限公司；鸡新城疫弱毒疫苗（La Sota株）购自广东永顺生物制药有限公司；ELISA抗原包被液、ELISA终止液和脱脂奶粉购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；HRP标记的羊抗鸡IgG购自北京博奥森生物科技有限公司；TMB单组份显色液购自百浩生物科技有限公司。

1.2 质粒、毒株、实验动物 重组质粒pET-32a-Vc、新城疫基因Ⅶd亚型重组病毒株rGM（强毒株）和新城疫基因Ⅶd亚型致弱重组病毒株rGM-Ⅶm（疫苗株）均由本实验室保存；SPF鸡购自广东温氏大华农生物科技有限公司。

1.3 重组蛋白Vc的原核表达及目的蛋白的纯化 本实验室已构建好的重组质粒pET-32a-Vc经测序鉴定序列正确后，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，扩大培养后再加入IPTG进行诱导表达。随后，使用SDSPAGE和Western blot方法对重组蛋白rVc进行可溶性分析与鉴定。再使用镍离子亲和层析法和蛋白胶切胶回收法对目的蛋白进行纯化。

1.4 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数的确定进行方阵滴定试验，具体操作为：取96孔酶标板，横排抗原包被浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4 μg/mL，按100 μL/孔包被酶标板，4℃静置过夜，PBST洗板5次；每孔加含7.5%脱脂奶粉的PBS，37℃封闭2 h，PBST洗板5次；竖排阴、阳性血清样品按1∶25、1∶50、1∶100和1∶200稀释，37℃作用1 h，PBST洗板5次；加入1∶8000稀释的HRP标记的羊抗鸡IgG，37℃作用1 h，PBST洗板5次；加入TMB单组份显色液，室温作用10 min后，加入ELISA终止液终止反应。

1.5 间接ELISA方法阴、阳性临界值的确定 用上述建立好的ELISA方法对60份NDV阴性血清进行检测，计算平均值（）和标准差（SD）。根据统计学原理，样品D450≥+3SD时判定为阳性，D450≤+2SD时判定为阴性，介于两者之间时为可疑值。

1.6 间接ELISA方法特异性验证实验 使用上述建立好的ELISA方法，检测H7N9与H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、K亚群禽白血病病毒（Avian leukosis viruses，ALVs）、鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）、鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）和禽腺病毒4型（Adenovirus，FAdV-4）阳性血清，以验证本方法是否与其他禽源病毒血清存在交叉反应。

1.7 动物实验及V蛋白抗体的检测 设计动物实验，具体方案见表1。动物实验结束后，对实验过程中采集的血清样品进行HI抗体检测，确定免疫成功后，再使用上述建立好的ELISA方法进行V蛋白抗体检测。

表1 动物实验方案Table 1 Animal experiment program

1.8 重复性试验 板内重复性试验：包被1次酶标板，按照上述建立好的ELISA方法，对4份阳性血清和4份阴性血清进行1次重复性检测，每份样品做3个重复，然后根据平均值和标准差计算变异系数；板间重复性试验：分别包被3次酶标板，对4份阳性血清和4份阴性血清进行3次重复检测，计算变异系数。

2 结果

2.1 重组蛋白rVc的原核表达及纯化 重组质粒pET-32a-Vc转化大肠杆菌，进行原核表达。诱导表达后的重组蛋白Vc存在于上清中，为可溶性蛋白。先使用镍离子亲和层析法对目的蛋白Vc进行纯化，纯化后的目的蛋白中含有少量杂蛋白，为了避免这些杂蛋白干扰后续ELISA方法的特异性，再使用PAGE胶蛋白回收法进行纯化。再次纯化后的目的蛋白中无明显的杂蛋白条带，见图1。

2.2 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数的确定 方阵滴定试验结果见表2，当抗原包被浓度为1.6 μg/mL，血清稀释倍数为1∶50时，ELISA反应后的阳性血清D450均值在1.0左右，且此时P/N值最大，即确定为最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数。

2.3 间接ELISA方法阴、阳性临界值的确定 60份阴性血清检测结果的平均值（）为0.164，标准差（SD）为0.043，根据统计学原理计算：样品D450≥+3SD（即0.29）时判定为阳性，D450≤+2SD（即0.25）时判定为阴性，介于两者之间时为可疑值。另外，为了降低环境因素和人为因素等差异对检测结果的影响，计算中引入S/P值对该ELISA方法的检测结果进行校正。

2.4 间接ELISA方法特异性验证实验 使用上述建立好的ELISA方法检测AIV、ALV-K、IBV、IBDV和FAdV-4阳性血清。检测结果均为阴性，表明该方法特异性良好，与其他常见禽源病毒血清无交叉反应。

2.5 实验动物血清HI抗体和V蛋白抗体检测结果 动物实验结束后，对全部血清样品进行HI抗体检测。结果表明：rGM-Ⅶm灭活疫苗组、La Sota灭活疫苗组、rGM-Ⅶm弱毒疫苗组和La Sota弱毒疫苗组均免疫成功，免疫3周后的HI抗体平均效价分别为10.1log2、8.3log2、8.3log2和7.6 log2；PBS组均为0log2；NDV强毒rGM株攻击后1周内，鸡全部死亡，故未按计划采集血清进行检测。采用上述建立好的ELISA方法对血清样品中的V蛋白抗体进行检测，检测结果见图2和图3。结果显示：PBS组和2组灭活疫苗组免疫后的3周内，V蛋白抗体检测结果均为阴性；两组灭活疫苗组免疫3周后，人工感染NDV强毒rGM株，攻毒后第7、14和21 d的V蛋白抗体阳性率分别为60%、80%、70%和50%、80%、70%，经计算，其S/P均值都＞0.29，因此，这两组可判定为阳性；两组弱毒疫苗组免疫后的3周内，第7 d和14 d的V蛋白抗体检测结果均为阴性，仅在第21 d分别检测出20%和10%的血清样品呈V蛋白抗体阳性，但经计算，其S/P均值都＜0.25，因此从群体水平上看，这两组也可判定为阴性。

图1 重组蛋白rVc原核表达及纯化后的SDS-PAGE(A)与Western blot(B)结果Fig.1 SDS-PAGE(A) and Western blot(B) results of prokaryotic expression and purification of rVc

表2 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数的确定Table 2 Determination of optimal antigen coating concentration and optimal serum dilution factor

2.6 重复性试验 采用上述建立好的ELISA方法，对4份阳性血清和4份阴性血清进行重复性试验。板内重复性试验和板间重复性试验结果的变异系数均＜10%，表明该方法重复性较好。

3 讨论

区分动物的免疫与感染（differentiation of infected from vaccinated animals，DIVA）是实现动物病毒性疫病净化的重要手段[8,11-12]。《国家中长期动物疫病防治规划》要求在2020年实现对种鸡场完成新城疫的净化，而疫病的净化要求在一定范围内清除病原体并保持无疫病状态，全面应用灭活疫苗，禁用活疫苗是实现疫病进化的重要前提。但是目前我国所使用的血清学诊断方法无法有效的鉴别NDV疫苗与野毒感染，需要建立一种新的方法。本研究从NDV复制的机制出发，基于非结构蛋白V仅在复制过程中大量产生这一现象，拟通过建立一种V蛋白抗体定量的ELISA方法，评估动物的感染状态。动物实验结果表明，灭活疫苗免疫后，ELISA检测结果为阴性，而野毒感染株阳性率在50%以上，存在显著差异，因此可以使用该方法对鸡群的免疫和感染状态进行有效的鉴别。同时，本研究也对弱毒株感染后的V蛋白抗体水平进行了检测，结果表明其阳性率不高于20%，远远低于强毒感染后的阳性率，该试验结果也为弱毒免疫和强毒感染的鉴别提供了新的方法，有助于禽场把握禽群感染情况并采取相应措施。此外，本研究实验结果同时表明，尽管鸡群免疫后会产生较高的HI抗体水平，可以保护鸡群不死亡甚至不发病，却无法彻底阻挡强毒的感染和复制，可能是导致免疫鸡群存在长期带毒的原因。

图2 免疫后的V蛋白抗体水平Fig.2 V protein antibody levels after immunization

图3 灭活疫苗免疫3周再攻强毒后的V蛋白抗体水平Fig.3 V protein antibody levels after inactivated vaccine immunization for 3 weeks

目前我国流行的NDV强毒以基因Ⅶ型为主，本研究中表达的重组蛋白Vc来源于基因Ⅶ型GM株，将其氨基酸序列与其他基因Ⅶ型NDV毒株（AF431744、AF473851、AY562985、AY865652、DQ83939、DQ485229、DQ485230、DQ659677和EU167540）的同源性为78.8%～97.1%，差异不大，与已有报道相符[13]。文献报道，V蛋白抗体与不同毒株的抗原均具有较好的反应性[14]，因此该检测方法能够对NDV基因Ⅶ型不同的毒株进行检测，具有一定的通用性。

综上，本文建立了一种新的ELISA 检测方法，可用于监测免疫禽群的NDV感染情况，特别是能够有效地鉴别灭活疫苗免疫和野毒感染，其应用有望于帮助养禽厂逐步实现新城疫的净化。