携带稻瘟病菌的大麦粒作为载体在杀菌剂筛选中的应用

邓 云 ，苏 妍 ，应薛养 ，许 卿 ，连 珊 ，方 旭 ，吴娟娟

（1．福建省南平市农业科学研究所，福建南平354200；

2．建阳市农业局，福建南平354200；3．南平市种子管理站，福建南平354200）

稻瘟病菌属于稻梨孢菌属。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻的主要病害之一，每年由其造成的水稻损失可占水稻总产量的10%～30%，是阻碍水稻高产、稳产的关键因素之一［1-2］。至今为止，稻瘟病遍及世界各大水稻主产区，其中以亚洲和非洲病情较为严重。福建省稻瘟病常年发生，严重危害水稻产量，一般情况下稻瘟病只在局部地区发生，如果品种感病，又逢有利于发病的气候条件，稻瘟病则会大面积发生、流行，对水稻生产造成极大威胁［3］。

目前，对稻瘟病的防治主要是化学药剂防治［4］。市场上防治稻瘟病的各类型各品牌杀菌剂种类繁多，由于耐药性和杀菌剂质量的影响使得这些杀菌剂对稻瘟病的防治效果参差不齐［5］。所以，在对稻瘟病进行防治之前需要筛选效果好的杀菌剂，而筛选杀菌剂是一件费时费力的工作。杀菌剂筛选分为实验室筛选和田间筛选两种，田间筛选主要是通过设置三重复小区，测试杀菌剂对稻瘟病田间发病的控制作用，相对实验室筛选耗费人力、物力、财力较多，不适合大批量筛选杀菌剂，因此，常采用实验室筛选方法来对稻瘟病药剂进行大批量初筛选［6-7］。现有的实验室筛选方法主要是采用菌丝生长速率法，具体为：先制备长满稻瘟病菌的大片菌饼；同时配置含有杀菌剂的平板培养基；然后，用菌种打孔器在大片菌饼上打取小颗粒菌饼，并将小颗粒菌饼长有菌丝的一面朝下放入含有杀菌剂的平板培养基中，恒温培养；最后通过测量平板培养基上以小颗粒菌饼为中心的菌落的直径大小来判断杀菌剂的杀菌效果（菌落直径越小，杀菌剂的杀菌效果越好）。但是，由于小颗粒菌饼的制作过程相对复杂，存在消毒不方便、操作过程繁琐等问题，效率低，不利于大批量快速筛选杀菌剂；并且，小颗粒菌饼仅一面长有菌丝，其接种于平板培养基后小颗粒菌饼四周的菌丝长势不均匀，影响菌落直径测量的准确性。因此，亟待寻找一种利于大批量快速筛选稻瘟病杀菌剂的方法。本技术方法提供一种快速筛选药剂的方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

大麦粒（用于培养稻瘟病菌丝）。

制作一个白底黑字的塑料圆形十字刻度板，直径为9 cm（如图1所示）放在平板培养基的正下方。

培养基为可溶性淀粉培养基，其成分为：可溶性淀粉10.0 g，酵母膏2.0 g，CaCO33.0 g，琼脂粉16.0 g，蒸馏水1 000.0 mL，pH 6.5。

1.2 试验方法

1.2.1 大麦粒培养稻瘟病菌 35 g（约1 000粒）大麦泡水0.5 h后煮沸至半熟，承装在250 mL的培养瓶中，高压灭菌。将稻瘟病菌接菌到高压灭菌过的大麦粒中，接菌后将培养瓶平放至培养箱内25～28℃培养7～10 d，期间摇动1次培养瓶，让已长出的稻瘟病菌丝均匀分布整个培养瓶，以便充分均匀生长。培养大麦粒所用的培养瓶为250 mL的茄形培养瓶，侧面为平面可以平放，有利于菌丝的横向生长。

1.2.2 含药剂平板培养基的制备 称取一定量的各杀菌剂有效成分，无菌水溶解，稀释成5个系列浓度药液，浓度分别为10.000、5.000、2.500、1.250、0.625µg/mL的药液。准确吸取药液依次加入到融化的可溶性淀粉培养基中（直径为9 cm的培养皿），充分摇匀，制备成含有所设计的药剂浓度梯度的平板培养基。同时设置不含药的平板作空白对照，每处理重复3次。

1.2.3 十字交叉放置大麦粒 将携带稻瘟病菌的大麦粒放在离十字刻度板（图1）的中心交叉圆点2～2.5 cm处，十字形对称放置，每个培养皿放4粒大麦粒。大麦粒放置时为防止后续因移动培养皿而造成大麦粒移动，应先在培养皿相对应的位置用灭菌烧过的镊子头在琼脂中点出小洞，后将长有菌丝的大麦粒镶嵌于其中，防止位移，封口膜封口培养皿边缘防止污染。

1.2.4 接菌后将平板培养基置放入25～28℃培养箱培养，7～10 d后调查结果，菌丝抑制效果见图2。

1.2.5 培养到预定时间后，取出培养皿测量大麦粒的菌落直径，采用卡尺以十字交叉法测量每个大麦粒的2个直径，每皿4个大麦粒一共测量8个数据，以其均数代表菌落大小。用以下公式计算各药剂处理对病菌菌丝生长的抑菌率：菌丝生长抑制率（%）=（1-处理菌落直径/对照菌丝生长）×100%。

1.2.6 根据各药剂浓度对数值及对应的菌丝生长抑制率几率值作回归分析，利用DPS分析软件计算出回归方程，求出抑制孢子萌发的药液浓度。

图1 培养皿十字刻度板示范

图2 菌丝抑制效果

2 讨论

大麦粒放置在培养皿中相对于牛津杯的菌饼操作更加简单方便，一瓶茄形培养瓶既可培养千粒以上大麦粒，而菌饼培养上千个至少需要几十个培养皿，耗时耗材，另外在接菌到培养基的过程中，大麦粒的操作也较之菌饼简单易行，同时也减少操作的污染。

大麦粒培养菌丝的优点，大麦粒菌丝的生长为立体三维的全方位生长，生长均匀，不同于菌饼生长为单面生长，接菌后大麦粒扩展菌丝也会较菌饼扩展的更加均匀。

塑料圆形十字刻度板底为白色，刻度为黑色，使用时将圆形刻度板放置于培养皿外侧底部，此种操作方便不易造成污染，可透过培养基看到底部进行操作。

综上所述，本发明的技术方案可大大提高稻瘟病杀菌剂筛选的效率，利于大批量快速筛选稻瘟病杀菌剂。