微酸性次氯酸液对屏障设施动态环境杀菌效果的研究*

白 冰 师长宏

(空军军医大学实验动物中心，西安 710032)

喷雾杀菌是实验动物屏障设施内进行微生物控制的常用方法，所使用的消毒溶液主要为含氯消毒剂。该类消毒剂主要成分为次氯酸盐。由于其工作浓度高、碱性强，具有易挥发、刺激性气味大、性质不稳定、腐蚀性强等缺点。微酸性次氯酸液作为一种新型含氯消毒剂，其有效氯浓度低，消毒性能优良、且腐蚀性小、极少有刺激性气味[1]，近年来颇受关注。本研究所用微酸性次氯酸液残留低，与有机物接触可瞬间杀菌、瞬间失活，即使吸入也无毒性。消毒时由于使用的是超微粒子的喷雾，不会润湿皮肤和眼睛。为检测该消毒液及其喷雾在屏障设施内的杀菌效果，实验选取动态饲养环境，进行单次和连续消毒，以获取屏障设施内最优微生物控制方案。

1 材料与方法

1.1 材料

NDX-1500PLB型微酸性次氯酸液生成器由OSG株式会社生产。生产能力70 L/h，功率为3 600 W，生产工艺见图1。标准菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC6538)菌株，沙门菌(Saimonella，ATCC13311)菌株，均购自ATCC。营养琼脂平板由本实验室制备。细菌悬液制备，按《中华人民共和国药典》2015版四部无菌检查法和微生物限度检查法和刘毅萍法[2-3]。

图1 次氯酸水生产工艺Fig.1 Production process of hypochlorite solution

1.2 检测方法

1.2.1制备细菌悬液，浓度达到1×107cfu/mL，然后将无菌滤纸制成1 cm×1 cm 方形纸片，将制片浸入菌液中放置10 min，后取出制片晾干制成菌片备用。吸取消毒剂5.0 mL于无菌小平皿内，将其置(20±1)℃水浴中5 min后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至试验预定的时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0 mL稀释液试管中，作用10 min。用电动混合器混合20 s，或将试管振打，吸取该最终样液1.0 mL，接种于营养琼脂平板中，(36±1)℃恒温培养箱培养24～48 h后菌落计数，并计算杀菌率[4]，每组实验重复3次。

1.2.2微酸性次氯酸液有效氯含量和pH值等理化指标检测参照文献[4]。

1.2.3检测微酸性次氯酸液对金黄色葡萄球菌和沙门菌杀灭作用。

1.2.3.1 模式Ⅰ：用微酸性次氯酸液喷雾设备对选取的屏障设施进行喷雾杀菌，单次工作15 min，30 min后不同时间点使用营养琼脂平板检测落下菌数，并计算杀菌率，每组实验重复3次。

1.2.3.2 模式Ⅱ：用微酸性次氯酸液喷雾设备对选取的屏障设施进行连续喷雾杀菌，每日工作6次，每次工作5 min，休息5 min，每日连续工作1 h，30 min后不同时间点检测落下菌数，连续工作21 d，每隔7 d检测落下菌数并计算杀菌率，每组实验重复3次。

1.2.3.3 模式Ⅲ:用酸化水对选取的屏障设施进行连续喷雾杀菌，每日工作2次(上、下午各一次)，每次连续工作30 min、连续工作21 d，每隔7 d检测落下菌并计算杀菌率，每组实验重复3次。

1.2.4实验选取的屏障设施为：5.6 m×6.0 m×2.5 m=84.0 m3；温度为23.1 ℃，相对湿度为56.3%；小鼠饲养数量为500只，开放饲养。

1.3 杀菌率计算

在微生物杀灭实验中，杀菌率(killing rate，KR)用百分率表示微生物被杀灭的数量，用于评价杀菌效果。实验组菌落数B1(cfu)，对照组菌落数B2(cfu)，按照下列公式计算KR：

2 结果

2.1 酸化水理化检验结果

有效氯含量为6.84×10-2g/L，pH值为6.24。

2.2 微酸性次氯酸液的杀菌率

微酸性次氯酸液对金黄色葡萄球菌和沙门菌作用15 min后的杀菌率可达到90%以上，见表1和图2。

表1 对标准株的消杀结果Table 1 Sterilization result for standard bactericidal strain

图2 微酸性次氯酸液对金黄色葡萄球菌和沙门菌平板菌落的影响Fig.2 Effect of microacid hypochloric acid on bacterial result of Staphylococcus aureus and Salmonella

2.3 模式Ⅰ检测结果

用微酸性次氯酸液喷雾设备单次工作15 min 后在2 h内杀菌率维持在90%，48～72 h杀菌率低于30%(表2和图3)。

表2 模式Ⅰ空气落下菌杀菌结果(喷雾15 min)Table 2 Sterilization results of mode Ⅰ air fall bacteria (sprayed for 15 min)

2.4 模式Ⅱ检测结果

21 d后杀菌率达到60%以上(表3和图4)。

表3 模式Ⅱ空气落下菌杀菌结果Table 3 Sterilization results of mode Ⅱ air fall bacteria

图4 模式Ⅱ不同时间点落下菌数Fig.4 The number of mode Ⅱ air fall bacteria at different time

2.5 模式Ⅲ检测结果

杀菌率可达到90%以上，见表4和图5。

表4 模式Ⅲ空气落下菌杀菌结果Table 4 Sterilization results of mode Ⅲ air fall bacteria

图5 模式Ⅲ不同时间点落下菌数Fig.5 The number of mode Ⅲ air fall bacteria at different time

3 讨论

含氯消毒剂广泛应用于实验动物屏障设施的日常消毒，通常是雾化后通过沾湿墙面的附着菌进行杀菌，属于迟效性杀菌，并且会呈大颗粒状浮游于室内。而当人进入房间后，会吸入大量的消毒剂或是附着于皮肤上或进入眼睛引起不适，对动物也会产生同样的危害，其毒性和残留性是在使用过程中存在的主要问题。因此，在确保屏障设施消毒效果的基础上，寻求高效、安全、可靠的消毒剂具有重要意义。

本实验选用的微酸性次氯酸消毒液残留性低、有瞬间杀菌力，与有机物接触会瞬间杀菌、瞬间失活，低浓度条件下即使吸入也无毒性。同时，为减少次氯酸残留并进一步提高消毒液的安全性[5]，将其分子结构中的次氯酸离子变为次氯酸分子。但消毒液喷雾后呈雾状漂流在室内，若雾中的次氯酸分子不与空中浮游菌接触则部分会气化蒸发，失去作用。为减少气化并提高次氯酸分子的比例，需要将液体pH值控制在7.0 以下。当液体pH值在5～6.5时溶液中次氯酸分子的比例高达90%以上，此时溶液的杀菌效果最好[6]。本实验使用的消毒液pH值为6.24，这也是其具有较强杀菌效果的主要原因。

实验中选取两种标准菌株模拟墙壁和器物表面附着的细菌，进行直接杀菌效果检测。结果显示，消毒液在15 min内能有效杀灭细菌，杀菌率可达到90%以上，表明消毒液在短时间内对物体表面细菌具有良好的杀菌能力，可作为屏障设施的特效杀菌剂。为进一步检测其对屏障设施内空气落下菌的杀菌效果，分别进行单次和连续杀菌效果检测，以获取单次杀菌后的最长维持时间和最佳杀菌时间。结果表明，单次喷雾工作后2 h内，杀菌率可维持在90%以上，超过48 h菌落数与对照无差异。而每日单次工作1 h，连续工作21 d，杀菌率也只能达到60%以上。为了提高杀菌率，实验将杀菌次数改为每日两次，每次持续工作30 min， 21 d后杀菌率可达到90%以上。以上结果充分说明，消毒液能有效杀灭屏障设施内的细菌，但需要进行长期连续的杀灭，并且要尽可能做到高频次，这样才能减少设施内动物感染的机率。如果在杀菌过程中出现间隔，最好控制在48 h之内，超出该时间点后细菌数量会有明显恢复。虽然该消毒液对人及动物无害，但有研究表明其对碳钢、铜为中度腐蚀，对铝为轻度腐蚀，由于对金属有轻度或中度腐蚀作用[7]，因此在屏障设施内使用时应尽量避免对上述金属直接作用。另有研究表明，其对芽孢的杀灭取决于所在载体不同而有所差异[7]，因此，制定杀灭策略时要根据不同环境进行有针对性的调整，才能收到预期效果。实验中所使用的喷雾设备也得到了充分的检测，证明其完全符合实验动物设施杀菌要求。虽然消毒液不能100%杀灭环境中的细菌，但其可靠性和高效率是明确的，尤其对实验动物屏障设施内微生物控制具有良好的作用，也为其他实验室的消毒提供了参考方案。