再生水灌溉水平对土壤盐分累积与细菌群落组成的影响

韩 洋，乔冬梅，齐学斌，李 平，郭 魏，崔丙健，陆红飞，赵宇龙，白芳芳，庞 颖

再生水灌溉水平对土壤盐分累积与细菌群落组成的影响

韩 洋，乔冬梅，齐学斌※，李 平，郭 魏，崔丙健，陆红飞，赵宇龙，白芳芳，庞 颖

（1. 中国农业科学院农田灌溉研究所，新乡 453000；2. 中国农业科学院新乡农业水土环境野外科学观测试验站，新乡 453000；3. 中国农业科学院农产品质量安全重点开放实验室，新乡 453000）

为探明再生水不同灌水水平下土壤盐分、氮素、磷素与细菌群落组成动态变化效应，采用室内土柱灌水试验，研究再生水、自来水不同灌水水平对土壤盐分、氮素、磷素及细菌群落组成结构的影响。结果表明：1）再生水灌溉相比自来水显著提高了0～60 cm土层盐分含量、磷素及0～30 cm土层氮素含量也有所提高，降低了土壤细菌群落多样性和OTU数量；充分灌溉相比非充分灌溉提高了深层土壤盐分含量，降低了深层土壤细菌群落多样性和种类数。2）不同处理土壤细菌类群以放线菌门（24.5%～40.6%）和变形菌门（22.4%～30.3%）为主。非充分灌溉下，再生水灌溉相比自来水提高了土壤放线菌门、绿弯菌门、厚壁菌门及酸杆菌门比例，降低了变形菌门比例；充分灌溉下，再生水灌溉相比自来水大幅度提高了土壤放线菌门和硝化螺旋菌门比例，降低了土壤变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门及厚壁菌门比例。无论是在充分灌溉还是非充分灌溉下，再生水灌溉均对土壤放线菌门表现为促进作用，对变形菌门表现为抑制作用。再生水充分灌溉相比非充分灌溉对土壤放线菌门和变形菌门具有促进作用，对土壤绿弯菌门、酸杆菌门和厚壁菌门具有抑制作用；再生水灌水水平越高，越有利于土壤中优势菌群的生长。3）各处理土壤细菌代谢通路丰度占比最大的为膜转运、碳水化合物代谢及氨基酸代谢，再生水辅以较高灌水水平能够显著促进表层土壤微生物膜转运、碳水化合物代谢及氨基酸代谢过程。因此，再生水较高灌水水平可促进土壤物质能量循环，且对土壤细菌代谢繁殖过程也可起到积极的调节作用。研究可为再生水灌溉下的土壤生态环境效应研究提供依据。

灌水；盐分；细菌；再生水；群落组成；代谢功能

0 引 言

随着经济发展与人口增长，工农业及生活耗水量与日俱增，淡水资源匮乏现状愈加受到重视；此外，随着人均用水量增加，城市污水排放问题也愈加严重[1-3]。因此，合理回用污水处理水及再生水对于缓解淡水资源供需矛盾、降低废弃污水排放的生态环境污染风险意义重大。近年来，国内外学者针对再生水灌溉相关领域展开了多方面研究，主要涉及再生水灌溉对作物生理生长的影响[4-7]、再生水灌溉对土壤环境质量的影响[8-12]、再生水回灌后农田及绿地生态环境系统污染风险评价等方面[13-15]。其中，关于再生水灌溉生态环境效应研究工作多集中于再生水回灌农田及绿地土壤后，土壤盐分、痕量重金属、有机污染物、无机污染物等累积和迁移转化规律的影响[16-22]，而从再生水灌水量调控的角度出发，针对再生水不同灌水水平条件下土壤细菌群落组成结构的影响研究却少见报道。土壤细菌作为农田土壤生态系统中的重要生物组成部分，其群落结构及功能多样性与土壤环境质量密不可分[23]；在土壤结构形成、物质循环、腐殖质组成、毒性物质降解及微环境净化等方面均起到重要的推动作用[24-27]。土壤细菌群落组成可直观反映土壤微环境中现存的细菌类群、丰度及其与土壤环境间互作下的多样化程度，特定的细菌群落组成对于维系农田土壤生态功能及改善土壤微环境等方面至关重要[28-29]。因此，通过探明再生水不同灌水水平下的土壤细菌群落组成特征可直观把握再生水不同灌水量调控下的土壤微环境动态变化机制。为此，本研究通过室内土柱灌水试验，以再生水和自来水不同灌水水平条件下的土壤为研究对象，探索再生水不同灌水水平对土壤细菌群落组成结构的影响，以期为再生水灌溉下的土壤生态环境效应研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤与试验用水

试验用土取自中国农业科学院农业水土环境野外科学观测试验站周边0～20 cm耕层土壤，质地为砂壤土。土样经风干后剔除动植物残体及石块，过2 mm筛，混合均匀后取部分土样装入密封袋，带回实验室用于测定土壤基本理化性状，其余土样封存用于装填土柱。供试土壤干容重1.42 g/cm3，有机质质量分数为8.68 g/kg，全氮量0.21 g/kg，全磷量0.38 g/kg，电导率值为150.57 dS/m，pH值8.62，重金属Cd质量分数0.055 mg/kg，Pb质量分数5.357 mg/kg，Cu质量分数10.026 mg/kg，Zn质量分数42.971 mg/kg。

试验用再生水取自河南省新乡市骆驼湾污水处理厂，污水来源主要为2017年夏季—2018年夏季城市生活污水，污水处理工艺为A/O反硝化生物滤池及臭氧氧化组合工艺。表1给出本试验从开始到结束（2017年8月1日—2018年5月28日）每次灌水过程中水样检测结果的范围值。在长达10个月的试验时间内，再生水水质指标不可避免地在一定范围内进行波动，2017年9月及2018年5月含盐量存在轻度超标，而其他常规水质指标均符合农田灌溉水质标准（GB 5084—2005）、再生水水质标准（SL368—2006）和城市污水再生利用农田灌溉用水水质标准（GB 20922—2007）规定（表1）。

表1 试验用再生水及自来水水质

1.2 试验设计及过程

试验设自来水、再生水2种灌水水质，充分灌溉、非充分灌溉2种灌水水平，充分灌水处理保持土壤含水率为田间质量持水率（field water holding capacity，FH）的90%，非充分灌水处理保持土壤含水率为充分灌水处理的70%。共计4个处理，分别为：自来水非充分灌溉（CKDI）、自来水充分灌溉（CKFI）、再生水非充分灌溉（RWDI）、再生水充分灌溉（RWFI），每个处理重复3次。

试验用土柱填装容器为硬质PVC管材，外径 × 高 = 40 cm × 70 cm，壁厚0.98 cm。土柱底部（反滤层位置处）设有排水孔，用于收集尾水，柱体上方布设有管道式灌水系统，每个土柱均在土面上方等间距插入4个滴头，以保证灌溉水均匀、稳定下渗。柱体由下至上依次是3 cm反滤层、40～60 cm土壤、20～40 cm土壤、0～20 cm土壤，土柱顶部预留7 cm高度不填土以备灌水时利用。分别在柱体各个深度土层埋设土壤负压计，用于监测土柱不同深度土层土壤水分情况。

供试土壤经自然风干、筛分后，以容重1.42 g/cm3计算每5 cm土层所需填装的土壤质量，土壤分层由下至上装入PVC柱内，每个土柱均分12次填装，每次填装均保证土壤颗粒分布均匀。在土壤填装过程中，严格将土柱内壁边缘土壤压实，以保证灌水时无贴壁水流入渗，尽量避免边缘效应发生。试验从2017年8月1日—2018年5月28日于室内进行，充分灌水处理每次灌水量9.70 L，非充分灌水处理每次灌水量6.80 L。灌水周期为20 d，整个试验周期内累计灌水15次，在试验开始后的301 d分层取土，分析0～60 cm土层土壤电导率（electrical conductivity，EC）、总氮（total N，TN）及总磷（total P，TP）含量与细菌群落组成结构。

1.3 测试指标与方法

土壤电导率值通过电导法（DDB-303A型便携式电导率仪，上海雷磁）测定；土壤总氮、总磷量采用流动分析仪（德国BRAN LUEBBE AA3）测定；细菌群落组成通过Miseq高通量测序平台完成。首先利用脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒（MOBIO Power Soil DNA Isolation Kit）抽提土样总DNA，取1L提取后的样品，采用1%琼脂糖凝胶对土样总DNA进行电泳检测，经检测后得到所有样品条带清晰正常，符合检测标准，从而进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR正式扩增采用Trans Gen AP221-02：Trans Start FastPfu DNA聚合酶，20L反应体系：5×FastPfu缓冲液4L，2.5 mmol/L dNTPs 2L，正向引物（5mol/L）0.8L，反向引物（5mol/L）0.8L，FastPfu聚合酶0.4L，BSA 0.2L，模板DNA 10 ng，补加ddH2O至20L。16S rRNA引物为338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT。抽取3L扩增后产物，利用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR产物，检测结果见图1。电泳检测结果表明，PCR扩增产物目的条带均位于750 bp，均为A级，大小正确，浓度合适，扩增结果满足试验要求。

注：1～3、4～6、7～9分别为自来水非充分灌溉下0～20、>20～40、>40～60 cm土层；10～12、13～15、16～18分别为自来水充分灌溉下0～20、>20～40、>40～60 cm土层；19～21、22～24、25～27分别为再生水非充分灌溉下0～20、>20～40、>40～60 cm土层；28～30、31～33、34～36分别为再生水充分灌溉下0～20、>20～40、>40～60 cm土层。

1.4 数据处理与分析

应用Excel 2010 和 SAS 9.2对数据进行方差分析；选取95%置信水平，应用最小显著差异法（least significant difference，LSD）进行不同处理间的多重比较分析。高通量测序结果中，只保留长度介于200～400 bp之间的片断，舍去小于200 bp和大于400 bp的片段。由于相对含量过小的序列（operational taxonomic units，OTU）不会对细菌群落结构产生显著影响，因而舍去相对含量小于1%的OUT。利用R语言工具对土壤细菌群落组成进行分析；16S功能预测分析首先利用PICRUSt软件对样本OTU进行标准化，排除物种基因组中Copy成分的干扰，进而根据各序列所对应的greengene id，获得各OTU所对应的COG和KEGG信息，计算COG丰度和KEGG丰度。

细菌多样性指数计算方法见文献[30]。Chao指数计算公式为[30]

式中为实际观测到的OTU数；1为只含有1条序列的OTU数目；为只含有2条序列的OTU数目。

ACE指数计算公式为[30]

式中n表示含有条序列的OTU数；abund为多于“abund”条序列的OTU数，abund为“优势OTU”阈值，默认为10。

Simpson指数计算simpson公式为[30]

Shannon指数shannon计算公式为[30]

式中obs为实际观测到的OTU数；为所有序列数。

Coverage指数计算公式为[30]

式中1为所抽样本中出现的总序列数。

2 结果与分析

2.1 再生水灌水水平对土壤盐分累积、总氮及总磷分布的影响

试验结束后不同处理土壤盐分累积情况、总氮及总磷含量见表2。采用EC代表土壤盐分状况，由表可知，无论是在充分灌溉还是非充分灌溉条件下，再生水灌溉下的土壤可溶性盐含量均显著高于自来水灌溉（＜ 0.05）。可见，再生水灌溉相比自来水显著提高了土壤盐分含量，增加了土壤积盐风险。因此在再生水工艺处理过程及农业生产回用过程中应严格控制水中盐分含量，避免因长期灌溉而造成土壤盐渍化，降低土壤质量。再生水不同灌水水平对比分析结果表明，2种灌水水平下的表层0～10 cm土层盐分含量差异不明显（＞ 0.05），而在＞10～20 cm土层，充分灌溉显著低于非充分灌溉（＜0.05），较之降低25.3%；＞20～60 cm土层，充分灌溉则显著高于非充分灌溉（＜0.05），相比分别提升55.1%、62.9%及122%，平均提升73.5%。综上，再生水灌溉过程中土壤盐分累积现象不容忽视，合理控制再生水中盐分含量水平及优化再生水灌水水平对于降低因再生水灌溉而引起的土壤积盐风险具有重要的现实意义。

灌溉300 d后，无论是在充分灌溉还是非充分灌溉条件下，再生水灌溉下的0～30 cm土层土壤总氮含量均显著高于自来水（＜0.05）；充分灌溉条件下，再生水灌溉下的0～10、＞10～20、＞20～30 cm土层总氮含量分别较自来水灌溉提升12.7%、13.9%及17.4%；而在非充分灌溉下，再生水灌溉下的0～10、＞10～20、＞20～30 cm土层总氮含量分别较自来水灌溉提升16.1%、15.4%及11.2%；＞30～60 cm土层无显著差异（＞ 0.05）。再生水灌溉一定程度上提高了表层土壤总氮含量，2种灌水水平下的0～60 cm各层土壤总氮含量均无显著差异（＞0.05）。无论是在充分灌溉还是非充分灌溉条件下，再生水灌溉下的0～60 cm各层土壤总磷含量均显著高于自来水（＜0.05）。再生水灌溉大幅度提高了土壤磷素含量，土壤中磷素含量水平主要受到土壤本身吸附量、植物根系提取量和灌溉及施肥输入量影响，作物对磷素的吸收途径主要来源于土壤供给，但由于土壤中绝大部分磷元素吸附于土壤胶体表面，其形态较为稳定且移动性较差，因此输入到土壤中的磷素绝大部分难以输出，加之本试验中土柱不种植作物，磷素主要来源于再生水灌溉。因此推断导致土壤总磷含量显著提高的主要原因是再生水工艺处理过程中磷素去除不彻底，水中磷素含量较高。除＞20～30 cm土层外，再生水充分灌溉下各土层总磷含量均显著高于非充分灌溉（＜0.05）；再生水灌溉下土壤磷素累积状况受灌水水平的影响显著，较高灌水水平也伴随着相对更高的磷素输入量，因此在再生水回用过程中应合理控制其灌水水平。

表2 各处理不同土层土壤盐分、全氮及全磷含量

注：同列数据后不同字母表示同一土层不同处理间存在显著性差异（＜0.05）；CKDI、CKFI、RWDI、RWFI分别代表自来水非充分灌溉、自来水充分灌溉、再生水非充分灌溉、再生水充分灌溉，下同。

Note: Different letters after the same column of data indicate that there is significant difference between different treatments of the same soil layer (＜0.05)，CKDI, CKFI, RWDI and RWFI represent that deficit irrigation with tap water, full irrigation with tap water, deficit irrigation with reclaimed water, full irrigation with reclaimed water, the same as below.

2.2 不同处理土壤细菌稀释曲线

稀释曲线主要通过各样本在不同测序深度下的细菌多样性指数作为标准来构建曲线，进而反映各样本在不同测序深度下的物种多样性，比较测序数据量不同的样本中所含物种的丰富度、均匀性及多样性，反映样本测序情况是否合理[31]。在相似度为97%的水平上，各处理稀释曲线见图2。各处理稀释性曲线均未完全趋于平缓，说明新物种还有可能随测序深度的增强而不断增加；随着测序序列数的增加，4个处理下的土壤细菌稀释曲线均逐渐趋于平缓，表明测序数量能够满足测序要求。

注：横坐标表示土壤样品随机抽取的测序数量，α = 0.03。

2.3 再生水不同灌水水平下土壤细菌群落多样性分析

Alpha多样性指数可有效反映某特定生态系统内的物种多样性情况，较为代表性的度量标准有Chao、Shannon、ACE、Simpson、coverage指数。其中Chao与ACE指数常用来估计物种总量，能够较好地对样本丰富度进行评估；Simpson指数常用来在生态学中定量描述一个系统的生物多样性情况，其值越大，说明细菌群落多样性越低。Shannon指数与Simpson指数相似，可在一定程度上反映群落alpha多样性；但其衡量标准与Simpson指数相反，Shannon指数数值越大，则说明细菌群落种类越丰富。Coverage指数可有效反映样本覆盖率，其数值越高，则样本中序列测出概率越高，该指数能够反映出样本测序结果的真实性和可靠性。本研究选取97%的相似度水平（= 0.03），对CKDI、CKFI、RWDI、RWFI 4个处理下的不同土层土壤细菌群落alpha多样性指数进行统计分析见表3。结果表明，非充分灌溉条件下，再生水灌溉相比自来水显著降低了＞20～40 cm土层ACE指数和Chao指数（<0.05），分别较之降低7.1%和6.4%，对Shannon、Simpson、coverage指数均无显著影响（>0.05）。而在充分灌溉条件下，与自来水灌溉相比，再生水灌溉显著降低了0～20 cm、＞ 40～60 cm土层Chao指数和ACE指数（<0.05），分别较之降低4.9%、5.8%和6.3%、5.8%；显著提高了0～20、＞20～40、＞40～60 cm土层Simpson指数（<0.05），分别较之提升194.3%、80.0%和24.2%。再生水和自来水灌溉下的各土层Shannon指数和coverage指数均无显著差异（>0.05）。再生水灌溉降低了土壤ACE指数和Chao指数，提高了土壤Simpson指数，可推断再生水灌溉显著降低了土壤细菌群落种类数和群落结构多样性。与非充分灌溉相比，再生水充分灌溉显著提高了0～20、＞20～40、＞40～60 cm土层Simpson指数，分别较之提升106.3%、15.8%和24.2%；降低了＞40～60 cm土层ACE指数和Chao指数（<0.05），分别较之降低5.1%和5.2%。可见再生水充分灌溉相比非充分灌溉降低了土壤细菌群落结构多样性及深层土壤细菌丰度。

表3 不同处理下土壤细菌群落多样性

2.4 土壤盐分、全氮及全磷与细菌群落多样性间的相关性分析

土壤盐分、全氮及全磷与细菌群落多样性间的相关性见表4。土壤EC值与ACE、Shannon、Chao指数间呈极显著负相关（＜0.01），与Simpson指数间呈显著正相关（＜0.05），可见较高的含盐量会降低土壤中细菌群落多样性和丰度。土壤TN与ACE、Shannon、Chao指数间呈显著正相关（＜0.05），与Simpson指数间呈显著负相关（＜0.05），可见土壤中适度的氮素水平一定程度上有利于促进细菌群落多样性和丰度的提升。土壤TP与ACE、Chao指数间呈极显著负相关（＜0.01），与Shannon指数间呈显著负相关（＜0.05），与Simpson指数间呈显著正相关（＜0.05），可见土壤中磷素水平偏高不利于细菌群落多样性的提升。

表4 土壤化学指标与细菌群落多样性间的相关性

注（Note）：*，＜0.05；**，＜0.01。

2.5 再生水不同灌水水平下土壤细菌OTUs分析

Venn图可统计不同处理土壤样本间共有及独有的物种（OTU）数量，能够直观反映出不同处理间物种组成相似性及重叠情况。不同处理OTUs组成及重叠情况见图 3。0～20 cm土层，CKDI与RWDI共有OTU数2 807，CKFI与RWFI共有OTU数2 703，RWDI与RWFI共有OTU数2 743。此外，CKDI、CKFI、RWDI、RWFI 4个处理独有细菌种类数分别为150、163、128、97。＞20～40 cm土层，CKDI与RWDI共有OTU数2 910，CKFI与RWFI共有OTU数2 786，RWDI与RWFI共有OTU数2 757。此外，CKDI、CKFI、RWDI、RWFI 4个处理独有细菌种类数分别为151、132、127、97。＞40～60 cm土层，CKDI与RWDI共有OTU数2 945，CKFI与RWFI共有OUT数2 811，RWDI与RWFI共有OTU数2 836。此外，CKDI、CKFI、RWDI、RWFI 4个处理独有细菌种类数分别为137、137、124、87。无论是在充分灌溉还是非充分灌溉条件下，与自来水相比，再生水灌溉均降低了0～60 cm土层OTU数；再生水不同灌水水平对比分析结果表明，充分灌溉相比非充分灌溉降低了各土层OTU数。

注：图中每个区域上数字表示落在该区域上的OTU数量，相似水平为97%。

2.6 再生水不同灌水水平下土壤细菌群落组成分析

在了解各OTU对应的物种后，因存在同一物种对应多个OTU的情况，故将相同物种分类的OTU合并，统计不同土层不同处理下的物种组成变化，探讨不同处理下的细菌群落组成。本研究在门水平上基于各处理前10的物种绘制物种组成柱状图，并将其他物种均归类于others，根据物种组成百分比进行相对丰度统计分析，结果见图4。在门水平上，不同灌溉处理下的土壤细菌类群以放线菌门（actinobacteria占比24.5%～40.6%）和变形菌门（proteobacteria占比22.4%～30.3%）为主，其次为绿弯菌门（chloroflexi占比12.4%～16.4%）、酸杆菌门（acidobacteria占比9.5%～17.9%）、芽单胞菌门（gemmatimonadetes占比3.4%～6.5%）、厚壁菌门（firmicutes占比2.2%～6.1%）、硝化螺旋菌门（nitrospirae占比1.7%～3.5%）、蓝细菌门（cyanobacteria占比0.4%～5.9%）等。相同灌水水平条件下，RWDI处理相比CKDI处理提高了＞40～60 cm土层土壤放线菌门比例、0～60 cm土层土壤绿弯菌门和厚壁菌门比例及0～20 cm土层土壤酸杆菌门比例，降低了土壤变形菌门比例；RWFI处理相比CKFI处理大幅度提高了0～60 cm土层放线菌门比例及硝化螺旋菌门比例，降低了土壤变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门及厚壁菌门比例。相同灌水水质下，RWFI处理相比RWDI处理提高了0～60 cm土层放线菌门和变形菌门比例，降低了绿弯菌门、酸杆菌门和厚壁菌门比例。

注：土层20、40和60分别代表0~20、>20~40、>40~60 cm。下同。

根据不同处理不同土层土壤样品在属水平上的丰度情况，结合物种与土壤样品绘制Heatmap图，进而分析不同物种在不同处理下不同土层中的聚集程度。筛选分类水平总丰度前30的物种，对组内重复样本丰度取均值，作Heatmap图。不同处理土壤细菌在属水平上的相对丰度见图5。4个处理各土层优势菌属均为诺兰克酸杆菌属（）和类诺卡氏菌属（）。再生水灌溉条件下硝化螺旋菌属（）、马氏菌属（）、、-18、等菌属的相对丰度均高于自来水，鞘脂单胞菌属（）、、、4-96等菌属相对丰度均较自来水灌溉有所降低。再生水灌溉相比自来水提高了一部分菌属的相对丰度，同时也使另一部分菌属丰度降低，整体最终仍趋于平衡。再生水充分灌溉下，、30--454-96等菌属相对丰度均低于非充分灌溉，而类诺卡氏菌属（）、马氏菌属（）、硝化螺旋菌属（）、-18等菌属的相对丰度均高于非充分灌溉。因此，再生水充分灌溉相比非充分灌溉提高了部分菌属相对丰度，同时也降低了另一部分菌属丰度，整体丰度仍趋于平衡。

图5 不同灌水处理下不同土层土壤细菌在属水平上的相对丰度

2.7 基于16S的土壤细菌功能预测分析

各土壤样本细菌COG功能一级分类统计见图6。不同处理下土壤细菌COG主要功能包括能量生产与转换、辅酶转运与代谢、脂质转运和代谢、氨基酸转运与代谢、碳水化合物转运与代谢、无机离子转运与代谢、一般功能性预测、转录、复制、重组和修复、细胞壁生物发生和信号传导、细胞分裂和染色体分割、核苷酸转运与代谢、胞体运动、次生代谢产物的生物合成与分解代谢、细胞内物质运输和分泌、防御、翻译、翻译后修饰、蛋白质转换、核糖体结构形成等功能。箱式图结果表明，各处理土壤样本中的细菌代谢功能较为丰富。其中功能丰度值在1 500 000以上的主要有氨基酸转运和代谢、一般功能性预测、能量生产与转换以及未知功能类物种；功能丰度介于1 000 000～1 500 000之间的主要有转录、信号转导机制、细胞壁生物发生和信号传导、碳水化合物转运和代谢、复制、重组和修复、无机离子转运与代谢、翻译、核糖体结构形成、脂质转运和代谢类物种；其余功能类物种丰度均小于1 000 000。可见，各处理下发挥功能较强的细菌物种主要致力于土壤中氨基酸转运和代谢、土壤主要能源的生产和循环转化等过程。此外，功能未知性物种尚有待于进一步探究。

不同处理0～60 cm土层细菌KEGG代谢通路丰度见图7。4个处理下的0～20、＞20～40、＞40～60 cm土层细菌群落代谢过程富集的通路主要包括能量代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、碳水化合物合成与代谢、聚糖生物合成与代谢、脂类化合物合成与代谢、维生素等辅助因子代谢、遗传物质加工和转录等多种基本代谢通路、萜类化合物和聚酮类化合物代谢、次生代谢产物的生物合成过程、细胞生长与死亡过程、细胞运动过程、内分泌过程、酶促反应过程、排泄过程、分类和降解过程、遗传信息处理过程、膜转运过程、神经系统反应过程、复制和修复过程、信号传导过程、通路间相互作用过程、转录和翻译过程、运输和分解代谢过程、异种生物的生物降解和代谢等过程。各处理土壤细菌代谢通路丰度占比最大的主要为膜转运、碳水化合物代谢及氨基酸代谢。其中，再生水充分灌溉处理下的0～20、＞20～40 cm土层的膜转运、碳水化合物代谢及氨基酸代谢通路丰度均显著高于其他3个处理，RWFI处理下的0～20、＞20～40 cm土层膜转运代谢通路丰度相比RWDI、CKFI、CKDI处理分别提升 16.5%、10.2%、10.1%和12.4%、12.7%、11.2%；RWFI处理下的0～20、＞20～40 cm土层碳水化合物代谢通路丰度相比RWDI、CKFI、CKDI处理分别提升21.4%、15.9%、15.7 %和14.7%、14.6%、10.5%；RWFI处理下的0～20、＞20～40 cm土层氨基酸代谢通路丰度相比RWDI、CKFI、CKDI处理分别提升20.2%、14.7%、13.9%和14.6%、14.7%、10.1%；＞40～60 cm土层差异不显著。

注：E，氨基酸转运与代谢；S，未知；R，一般功能预测；C，能源生产和转换；K，转录；T，信号传导机制；M，细胞壁、细胞膜及包膜生物形成；G，碳水化合物运输和代谢；L，复制、重组和修复；P，无机离子转运与代谢；J，翻译及核糖体结构形成；I，脂质转运与代谢；H，辅酶转运与代谢；O，蛋白质转换及修饰；Q，次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢；F，核苷酸转运与代谢；V，防御机制；U，细胞内分泌及膜泡转运；N，细胞运动及细胞分裂；D，染色体分裂及周期控制；A，RNA加工与修饰；B，染色质结构作用；Z，细胞骨架；W，细胞外结构；Y，细胞核结构代谢。

3 讨 论

本试验通过高通量测序技术研究了再生水不同灌水水平下的土壤细菌群落组成动态变化特征；结果表明，再生水灌溉下土壤细菌群落组成与代谢功能响应特征明显。土壤细菌多样性可反映土壤细菌群落状态、生态特性及土壤环境质量特征，主要包括物种多样性、结构多样性、功能多样性及遗传多样性，合理的土壤细菌群落多样性是维系土壤环境长久稳定发展的重要保障[32-35]。以往研究表明，再生水灌溉可提高土壤细菌群落多样性[36]，但也有研究指出再生水灌溉下土壤细菌多样性变化不显著或呈下降趋势[37-38]。本研究中，再生水灌溉下ACE和Chao指数相比自来水灌溉有所降低，Simpson指数有所提高，可见再生水灌溉一定程度上降低了土壤细菌群落多样性。土壤细菌群落多样性及种群结构受土壤环境中多重因素的动态变化制约[39]；土壤温度条件、水分条件、有机质含量、可溶性盐含量、土壤pH等因素的动态变化均会导致土壤细菌多样性发生显著改变[40-41]。大量研究表明，再生水中含有较高的盐分离子，灌溉后极易导致土壤积盐，增加土壤盐渍化风险[42-44]。本研究中，再生水灌溉显著提高了土壤盐分含量，增加了土壤积盐风险。土壤盐分含量的升高一定程度上会对土壤细菌生境条件造成负面效应，从而降低土壤细菌群落多样性[45]；此外，土壤积盐易引起土壤pH升高，降低土壤中有机碳活性，进而抑制微生物种群多样性的提升[40]。因此推断再生水灌溉土壤细菌多样性降低的主要原因是再生水灌溉增加了土壤盐分含量，细菌生长代谢受到土壤中盐分离子的胁迫，进而降低其多样性。本研究中土壤盐分与ACE、Shannon、Chao指数间呈极显著负相关，与Simpson指数间呈显著正相关，也证实了土壤中盐分含量较高会对细菌代谢产生胁迫，从而降低土壤中细菌群落多样性和丰度。再生水充分灌溉相比非充分灌溉显著提高了0～60 cm土层Simpson指数，降低了深层土壤ACE和Chao指数，可见充分灌溉一定程度上降低了深层土壤细菌群落多样性。原因可能是在充分灌溉条件下，再生水向深层土壤输送的盐分离子浓度相对更高，进而增加了深层土壤细菌生长代谢受抑制程度，降低其多样性。

本研究中，各处理土壤细菌类群以放线菌门和变形菌门为主。不同灌水水平下经再生水灌溉后的土壤细菌组成变化与自来水相比存在一定差异；非充分灌溉下，再生水灌溉相比自来水提高了土壤放线菌门、绿弯菌门、厚壁菌门及酸杆菌门比例，降低了变形菌门比例；而在充分灌溉下，再生水灌溉相比自来水大幅度提升了土壤放线菌门和硝化螺旋菌门比例，降低了土壤变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门及厚壁菌门比例。无论是在充分灌溉还是非充分灌溉下，再生水灌溉均对土壤放线菌门表现为促进作用，对变形菌门表现为抑制作用，这与以往研究结果相似[46]。原因可能是放线菌对土壤中各类污染物的抵抗与降解能力较强，在应对外界环境变化时往往表现出较强的耐受性[47]；此外，再生水本身具有较强的水质异质性[48]，不能排除其中还含有部分与放线菌具有协同生存能力的菌种，促进其繁殖。本研究中再生水灌溉刺激了土壤放线菌门的生长繁殖，推断再生水灌溉一定程度上可促进土壤有机化合物矿化和物质能量循环，降解土壤中毒性物质，不会对土壤环境造成较大的负面影响。变形菌群落范围分布较广，大部分类群具有固氮作用[49]。本研究中再生水灌溉抑制了土壤变形菌群的繁殖，初步推断长期再生水灌溉一定程度上不利于土壤固氮。而导致这种现象的原因可能是土壤中不同菌群之间存在竞争机制[50]，此外由于土壤及灌溉水源中的养分含量有限，且土柱装置空间封闭，使得变形菌门当中的部分菌属在与土壤中其他菌群争夺有限空间和养分的过程中受到抑制，进而降低其整体比例。再生水充分灌溉相比非充分灌溉对土壤放线菌门和变形菌门均具有促进作用，而对绿弯菌门、酸杆菌门和厚壁菌门则起到抑制作用。放线菌门和变形菌门是土壤中占比最大的两大优势菌门，本研究中再生水充分灌溉相比非充分灌溉促进了此2种优势菌门的生长，同时抑制了绿弯菌门、酸杆菌门和厚壁菌门等一类非优势菌群的生长；可见再生水灌水水平越高，越有利于土壤中优势菌群的代谢繁殖。

本研究中，再生水辅以较高灌水水平显著提升了表层土壤细菌膜转运、碳水化合物代谢及氨基酸代谢过程。碳水化合物代谢过程往往依赖于多种微生物彼此之间相互配合；此外，微生物本身是否具有特定的碳水化合物摄取和代谢基因对于形成良好的代谢网络至关重要[51]。本研究中再生水充分灌溉处理相比其他各处理显著提高了表层土壤碳水化合物代谢通路丰度，推断再生水辅以较高灌水水平一定程度上可增加土壤中携带碳水化合物摄取代谢基因的细菌种类及数量，进而使表层土壤碳循环转化效率得到提升。本研究中，再生水充分灌溉相比其他处理显著提高了表层土壤氨基酸代谢通路丰度，这可能与充分灌溉条件下再生水向土壤表层输送的盐分离子浓度较高有关。相关研究表明，盐分胁迫会使生物细胞质膜渗透压升高，影响其渗透调节机制，促使生物体内的氨基酸转化为糖、糖醇及游离态氨等一类小分子有机物来降低细胞内水势，进而加速氨基酸代谢过程[52]。除以上代谢通路外，能量代谢、脂类化合物合成与代谢、核苷酸代谢、维生素等辅助因子代谢、转录、复制及修复等代谢功能在丰度组成上也占有一定比例；且于再生水充分灌溉条件下0～40 cm土层中，这几类代谢通路丰度均略高于其他处理。由此可推断再生水较高灌水水平可在一定程度上促进土壤物质能量循环，此外对土壤细菌代谢繁殖过程也可起到积极的调节作用。

4 结 论

1）再生水灌溉相比自来水显著提升了土壤盐分、磷素及表层土壤氮素含量，降低了土壤细菌群落多样性；充分灌溉相比非充分灌溉提高了深层土壤盐分含量，降低了深层土壤细菌群落多样性。

2）土壤细菌类群以放线菌门（24.5%～40.6%）和变形菌门（22.4%～30.3%）为主，与自来水相比，再生水灌溉对土壤放线菌门表现为促进作用，对变形菌门则表现为抑制作用。此外，非充分灌溉下，再生水相比自来水提高了土壤绿弯菌门、厚壁菌门及酸杆菌门比例；充分灌溉下，再生水相比自来水提高了硝化螺旋菌门比例。再生水充分灌溉相比非充分灌溉对土壤放线菌门和变形菌门具有促进作用，而对绿弯菌门、酸杆菌门和厚壁菌门具有抑制作用，再生水灌水水平越高，越有利于土壤中优势菌群的生长，同时不利于非优势菌群的代谢繁殖。

3）土壤细菌代谢通路丰度占比最大的为膜转运、碳水化合物代谢及氨基酸代谢；再生水辅以较高灌水水平能够显著促进表层土壤细菌膜转运、碳水化合物代谢及氨基酸代谢过程。

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Effects of reclaimed water irrigation levels on soil salinity and composition of soil bacteria community

Han Yang, Qiao Dongmei, Qi Xuebin※, Li Ping, Guo Wei, Cui Bingjian, Lu Hongfei, Zhao Yulong, Bai Fangfang, Pang Ying

(1.,,453000,; 2.,,453000,; 3.,,453000,)

Reasonable reuse of reclaimed water is of great significance to alleviate the conflict between supply and demand of fresh water resources and reduce the risk of ecological environment pollution caused by waste sewage discharge. This stud aimed to reveal the effect of different irrigation levels of reclaimed water on soil salinity, total nitrogen, total phosphorus and bacteria community structure. The reclaimed water was collected from a sewage treatment plant. The designed irrigation water sources included reclaimed water and tap water. For each water source, 2 levels of irrigation were designed: full irrigation (90% of field water holding capacity) and deficit irrigation (70% of full irrigation). The soil column experiment was carried out from August 1, 2017 to May 28, 2018. The irrigation amount of full irrigation was 9.70 L per time, and that of deficit irrigation was 6.80 L per time. Water was irrigated every 20 d, and 15 times of irrigation were accumulated in the whole experiment period. Soil sample at 0-60 cm layer was collected after experiment which lasted for 300 days for determination of electrical conductivity, total nitrogen, total phosphorus and bacterial community structure. Soil bacteria diversity index was calculated. The results showed that: 1) Compared with tap water, reclaimed water irrigation significantly increased 0-60 cm soil salinity, total phosphorus content and 0-30 cm soil total nitrogen content, soil bacteria diversity and operational taxonomic units (OUT) were reduced under reclaimed water irrigation. Compared with deficit irrigation of reclaimed water, full irrigation of reclaimed water increased salinity in deep soil, the bacteria diversity and species number in deep soil were reduced under full irrigation of reclaimed water. 2) The soil bacteria under different treatments were mainly actinobacteria and proteobacteria. At deficit irrigation level, compared with tap water, the proportion of soil actinobacteria, chloroflexi, acidobacteria and firmicutes were increased but the proportion of soil proteobacteria were reduced under reclaimed water irrigation. Under full irrigation level, compared with tap water, the proportion of soil actinobacteria and nitrospirae were increased but the proportion of soil proteobacteria, chloroflexi, firmicutes and acidobacteria were reduced under reclaimed water irrigation. Regardless of irrigation levels, the irrigation with reclaimed water promoted soil actinobacteria and inhibited proteobacteria. Compared with deficit irrigation of reclaimed water, full irrigation of reclaimed water promoted soil actinobacteria and proteobacteria, and inhibited soil chloroflexi, acidobacteria and firmicutes bacteria. The high irrigation level of reclaimed water would favor the growth of dominant microorganisms in soil. 3) Membrane transport, carbohydrate metabolism and amino acid metabolism accounted for the largest proportion of bacteria metabolic pathways in all the treatments. Reclaimed water irrigation with high level greatly promoted the bacteria membrane transport, carbohydrate metabolism and amino acid metabolism of surface soil. Therefore, reclaimed water with high irrigation level would promote the cycle of material and energy in soil, and actively mediate the process of soil bacteria metabolism and reproduction.

irrigation; salinity; bacteria; reclaimed water; community composition; metabolic function

韩 洋，乔冬梅，齐学斌，李 平，郭 魏，崔丙健，陆红飞，赵宇龙，白芳芳，庞 颖. 再生水灌溉水平对土壤盐分累积与细菌群落组成的影响[J]. 农业工程学报，2020，36(4)：106－117. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.013 http://www.tcsae.org

Han Yang, Qiao Dongmei, Qi Xuebin, Li Ping, Guo Wei, Cui Bingjian, Lu Hongfei, Zhao Yulong, Bai Fangfang, Pang Ying. Effects of reclaimed water irrigation levels on soil salinity and composition of soil bacteria community[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(4): 106－117. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.013 http://www.tcsae.org

2019-07-24

2019-12-10

国家自然科学基金项目（51879268、51679241、51709265）；中央级科研院所基本科研业务费专项（FIRI2018-02）

韩 洋，实习研究员，主要从事非常规水资源安全高效利用研究。Email：13940585693@163.com

齐学斌，研究员，主要从事农业水资源优化配置与调控研究。Email：qxb6301@sina.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.013

S154.3; S155.4+4

A

1002-6819(2020)-04-0106-12