巨噬细胞抑制因子-1在慢性丙型肝炎患者外周血中的表达及意义

叶松道 叶宣梅 王晓欧 林巍

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染而导致的传染性疾病，我国HCV感染者约有1 476.5万，居全球首位[1]。HCV感染后不能及时清除而发展为慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC），是肝硬化、肝细胞癌的主要致病原因之一，因此对丙型肝炎慢性化机制的研究以及如何预测并提高干扰素（IFN）治疗应答率仍然是目前关注的热点[2]。巨噬细胞抑制因子-1（macrophage inhibitory cytokine-1，MIC-1）又称生长分化因子-15，是转化生长因子-β超家族的成员之一。研究表明，MIC-1在健康人体内低表达，但在炎症与外伤等病理或应激作用下表达上调[3]。近来有研究发现MIC-1在慢性乙型肝炎、肝硬化及小细胞肝癌组织中表达升高[4]。本研究通过测定CHC患者血浆MIC-1水平，探讨其与CHC患者体内病毒载量、肝脏损害程度及PR方案[聚乙二醇干扰素 α（Peg IFN-α）+利巴韦林（RBV）]抗病毒疗效的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017年9月至2018年8月在本院感染内科就诊的CHC患者57例，男32例，女25例；年龄10～76（39.26±9.22）岁。所有患者均符合《丙型肝炎防治指南（2015年更新版）》诊断标准[5]，艾滋病毒（HIV）抗体阴性，能接受PR治疗方案，即Peg IFN-α联合RBV治疗。排除合并慢性乙型肝炎等其他病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝炎等其他肝病患者。选取本院健康体检者26例作为对照组，男 15 例，女 11 例；年龄 13～74（38.55±10.06）岁。所有健康体检者均无肝肾疾病、血液病、自身免疫性疾病和心脑血管疾病，肝功能正常，经检测排除甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒和巨细胞病毒等感染，HIV抗体阴性。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有研究对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法与疗效判断 所有患者就诊后均应用PR 治疗方案，用法：Peg IFN-α-2a皮下注射，180μg/次，1周/次；RBV口服，800～1 000mg/d，基本疗程为 48 周。治疗前及治疗 4、12、24、48周监测HCV RNA，评估病毒应答情况并据此调整剂量。疗效判断[5]：（1）快速应答（RVR）：治疗第4周HCV RNA不可测；（2）早期应答：治疗第12周HCV RNA较治疗前下降＞2Log；（3）部分应答：治疗第12周HCV RNA较治疗前下降＞2Log，且第12周和第24周HCV RNA可测；（4）延迟应答：治疗第12周HCV RNA较治疗前下降＞2Log，但仍可测，第24周HCV RNA不可测；（5）无应答：治疗第12周 HCV RNA较治疗前下降＜2Log；（6）持续应答：治疗结束后第12周和第24周HCV RNA不可测。根据疗效将CHC患者分为应答组（包括快速应答、早期应答、部分应答、延迟应答和持续应答）和无应答组。

1.2.2 标本采集 所有患者于就诊后次日早晨空腹采集静脉血3～4ml，置于EDTA-K2抗凝管中并立刻上下颠倒混匀10次，3 000rpm离心5min，及时分离血浆于-40℃保存，用来检测血浆MIC-1、HCV RNA、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、四型胶原（C-Ⅳ）等指标，采集标本之前均未进行抗病毒治疗，未使用免疫调节剂。基本疗程结束（48周）后再次采集静脉血，检测MIC-1水平。

1.2.3 血浆MIC-1水平测定 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，严格按照试剂盒（苏州晶美生物科技有限公司）说明书进行操作，采用Anthos 2010型酶标仪（上海博赛思科技有限公司）检测样本及标准品光密度（OD）值，通过绘制标准曲线求待测样本MIC-1水平。个别样本OD值高于标准曲线上限，用样本稀释液适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

1.2.4 血浆ALT活性测定 采用速率法，在Siemens ADVIA2400全自动生化分析仪（美国西门子公司）上完成检测，采用原装试剂及校准品，正常参考范围为10～49U/L。

1.2.5 血浆C-Ⅳ水平测定 采用化学发光免疫分析，在MAGLUMI 2000全自动化学发光免疫分析仪（深圳新产业生物有限公司）上完成检测，采用原装试剂及校准品，正常参考范围为5.0～30.0ng/ml。

1.2.6 HCV RNA定量分析 采用实时荧光定量聚合酶链反应，试剂盒购自深圳匹基生物工程公司，在ABI 7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上完成检测，以HCV RNA≥5.0×102拷贝/ml为异常。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件。不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间和组内比较均采用Mann-Whitney U检验。CHC患者血浆MIC-1水平与ALT活性、C-Ⅳ水平及HCV RNA水平的相关性分析采用Spearman秩相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHC患者治疗前血浆MIC-1水平与对照组比较 治疗前CHC患者血浆MIC-1水平为369.84（193.51，830.62）pg/ml，明显高于对照组的 258.77（138.03，441.12）pg/ml，差异有统计学意义（Z=-2.801，P＜0.05）。

2.2 CHC患者不同ALT水平、C-Ⅳ活性及HCV RNA水平组血浆MIC-1水平比较 根据血浆ALT活性将CHC患者分为ALT升高组（＞49U/L）29例和ALT正常组（10～49U/L）28例，ALT升高组血浆 MIC-1水平高于ALT正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）。根据血浆C-Ⅳ水平将CHC患者分为C-Ⅳ升高组（＞30ng/ml）和C-Ⅳ正常组（5.0～30.0ng/ml），C-Ⅳ升高组血浆 MIC-1 水平高于C-Ⅳ正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）。根据血浆HCV RNA水平将CHC患者分为HCV RNA低水平组（＜2×106拷贝/ml）和 HCV RNA 高水平组（≥2×106拷贝/ml），HCV RNA高水平组血浆MIC-1水平高于HCV RNA低水平组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 CHC患者不同ALT水平、C-Ⅳ活性及HCV RNA水平组血浆MIC-1水平比较（pg/ml）

2.3 CHC患者血浆MIC-1水平与ALT活性、C-Ⅳ水平及HCV RNA水平的相关性分析 CHC患者血浆MIC-1水平与ALT活性、C-Ⅳ水平及HCV RNA水平均呈正相关（r=0.322、0.423和 0.333，均 P＜0.05）。

2.4 CHC患者血浆MIC-1水平与PR方案疗效的关系57例CHC患者中，有7例患者治疗后无法随访。随访的50例患者中，应答组37例，无应答组13例。两组患者治疗前后血浆MIC-1水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；应答组治疗后血浆MIC-1水平低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05），无应答组治疗前后血浆MIC-1水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 CHC患者不同疗效组血浆MIC-1水平比较（pg/ml）

3 讨论

据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为2.8%[6]，其中20%～30%的感染者可自发清除病毒，而70%～80%的感染者会呈持续感染，约30%的CHC最终发展成肝硬化和肝细胞癌。丙型肝炎肝损害的主要原因是HCV感染后引起的免疫学应答，其中细胞毒性T淋巴细胞起重要作用[7]。丙型肝炎慢性化机制还尚未阐明，一般认为是宿主免疫、遗传易感性和病毒共同作用的结果。

MIC-1最早由Bootcov等[8]在1997年从活化的巨噬细胞系克隆发现，主要参与器官生长、分化与发育。研究表明，MIC-1通过调节炎症反应和细胞凋亡途径参与了多个器官的损伤和多种疾病的进展，比如心血管疾病[9]、恶性肿瘤[10]和糖尿病[11]等。Hsiao 等[12]发现当肝脏损伤时，MIC-1水平明显上升。卢莺燕等[4]研究了MIC-1在慢性乙型肝炎和肝硬化中的表达，发现慢性乙型肝炎与肝硬化组患者血清MIC-1水平均明显增高，肝硬化组肝组织中MIC-1的表达明显高于慢性乙型肝炎组，且MIC-1水平与肝硬化程度呈正相关。Si等[13]在研究MIC-1与HCV复制的关系时发现，MIC-1可通过改变宿主肝细胞的信号传导和生长促进HCV的复制，并与HCV所致的原发性肝癌密切相关。张建等[14]发现CHC患者血清MIC-1水平与心脏左房内径、左室后壁厚度呈正相关，与射血分数呈负相关，检测MIC-1有助于评估患者心血管损害。

本研究显示，CHC患者血浆MIC-1水平明显高于正常人群，而且血浆MIC-1水平与患者HCV RNA载量、血浆ALT活性及C-Ⅳ水平均呈正相关。血清ALT活性在一定程度上可以反映患者肝细胞的损伤程度及病情严重程度，血浆C-Ⅳ水平与肝脏纤维化程度的密切相关，是反映肝纤维化较为特异和灵敏的指标，高灵敏度的HCV-RNA定量检测不仅是判断HCV感染的主要依据，也是丙型肝炎患者IFN疗效观察的重要参数[15]。研究结果表明，MIC-1可能参与了HCV的复制、肝细胞的损伤及肝纤维化过程，升高的血浆MIC-1水平或可作为HCV感染的潜在诊断标志物。然而，MIC-1在HCV感染中的具体作用机制并不明确，尚需更多的研究来证实。目前PR方案仍然是我国治疗CHC的重要手段[5]，与疗效有关的因素包括病毒因素（病毒载量、病毒基因型等）[16-17]和宿主因素（年龄、性别、种族、肝脏组织学及机体免疫状态等）[18]。本研究发现，应答组治疗后血浆MIC-1水平明显下降，而无应答组治疗前后血浆MIC-1水平比较差异无统计学意义，提示血浆MIC-1水平或可作为PR方案疗效的标志。然而，应答组与无应答组患者在治疗前血浆MIC-1水平比较差异无统计学意义，表明血浆MIC-1水平对PR方案治疗效果的预测没有显著意义。

总之，血浆MIC-1水平和CHC患者体内病毒载量、临床病情有着较为密切的关系，其水平测定或可作为体内HCV病毒载量、肝脏损害程度及PR方案抗病毒疗效的评价指标，但治疗前尚不能对PR方案疗效进行预测。