人端粒酶逆转录酶启动子DNA甲基化在卵巢良恶性肿瘤组织中的表达差异

李淞漪 吴迪 倪笑玲 李鼎恒 李迎华

卵巢是女性生殖器官好发肿瘤的器官，卵巢的良性肿瘤占女性生殖器良性肿瘤的1/4～1/3，可发生于任何年龄，但多见于生育年龄妇女。卵巢肿瘤的组织学类型极为复杂，部分良性肿瘤可发生恶变，可转化为卵巢癌或其他恶性度较高的肿瘤，给该病的根治带来困难。人端粒酶逆转录酶（human telomere enzyme reverse transcriptase，hTERT）是人端粒酶的核心亚基，在人类癌症中起重要作用[1]。hTERT的异常表达与肿瘤发生、细胞增殖、凋亡抑制、衰老逃逸和转移密切相关。对hTERT调控机制的深入了解是探讨肿瘤发病机制和寻找诊治方法的关键。研究证实包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤与hTERT启动子DNA甲基化相关[2-5]，目前检测hTERT启动子DNA甲基化是多种恶性肿瘤相关的研究热点。本研究通过检测卵巢良、恶性肿瘤组织中hTERT启动子DNA甲基化的差异，探讨卵巢癌发病机制与hTERT启动子甲基化的相关性。

1 材料和方法

1.1 组织标本 收集2017年1月至2019年2月在本院手术治疗的15例卵巢恶性肿瘤患者术中新鲜肿瘤组织标本，设为实验组；另取同期15例卵巢良性肿瘤患者术中新鲜肿瘤组织标本，设为对照组。纳入标准：（1）经手术治疗的卵巢肿瘤患者，术后病理检查确诊为卵巢良性赘生性肿瘤或卵巢恶性肿瘤；（2）入组患者术前均未接受任何治疗（如化疗、激素治疗等）。排除标准：（1）卵巢非赘生性肿瘤（如黄体囊肿、黄素化囊肿、卵巢血肿等）患者；（2）妊娠期妇女；（3）合并2种及以上原发恶性肿瘤患者。实验组患者年龄32～68岁，中位年龄45岁；病理类型：上皮性恶性肿瘤13例，未成熟性畸胎瘤2例；手术病理分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期5例，Ⅲ期3例。对照组患者年龄32～68岁，中位年龄43岁；行卵巢囊肿剥除术12例，行一侧附件切除术3例；病理类型：卵巢浆液性囊腺瘤8例，黏液性囊腺瘤3例，成熟性畸胎瘤4例；肿瘤分布：单侧卵巢12例，双侧卵巢3例；肿瘤直径：＜10cm 13例，≥10cm 2例。两组患者年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2 细胞标本 根据文献[6]，hTERT启动子DNA甲基化在宫颈癌细胞阳性表达，故培养Hela细胞3组，作为阳性对照组。

1.3 主要试剂 细胞/组织基因组 DNA提取试剂盒（GK0221）购自上海捷瑞生物科技有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测试剂（PCR SuperMix I）购自北京全式金生物技术有限公司；Hela细胞株购自中科院上海细胞库。

1.4 实验方法 依照DNA提取试剂盒说明书对实验组、对照组标本及Hela细胞提取DNA，对提取的DNA按EpiTect Bisulfite kit（Cat.no-59104）提供的说明书进行亚硫酸盐修饰，反应程序为：95°C变性5min，60°C温育 25min，95°C 变性 5min，60°C 温育 85min，95°C 变性5min，60°C 温育 175min，降到 20°C 保存。再将纯化的DNA洗脱下来。经处理后，DNA中所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）都转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶则不发生改变。然后进行甲基化特异性聚合酶链式反应（methylation specific polymerase chain reaction，MSP）法检测甲基化：通过methprimer平台（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi），依据人类 hTERT基因的启动子转录起始位点上游1 100～1 600bp范围富含胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鸟嘌呤（G）（CpG 岛）的序列，设计甲基化特异性引物（methylation specific primers，实验中用M表示）hTERT-MF/R：上游5′-GGAAGTGTTGTAGGGAGGTATTTC-3′，下游 5′-CTTTAACCGCTAACCTAATCCG-3′，扩增目的基因片段198bp；设计非甲基化特异性引物（unmethylated specific primers，实验中用U表示）hTERT-UF/R：上游 5′-GGAAGTGTTGTAGGGAGGTATTTT-3′，下游：5′-CTTTAACCAC －TAACCTAATCCAAA-3′，扩增目的基因片段长度198bp。应用上述两组引物组合进行PCR扩增，反应程序为：95°C 3min；95°C 15s，60°C 30s，72°C 20s，该步骤循环40次；72°C 7min，降到12°C保存。然后进行反应产物的琼脂糖凝胶电泳。

1.5 甲基化检测结果的判定标准 MSP法检测结果分析，如果甲基化特异性引物扩增出条带，非甲基化特异性引物未扩增出条带，说明hTERT基因启动子区CpG岛被检测位点发生了甲基化；如果甲基化特异性引物未扩增出条带，非甲基化特异性引物扩增出条带，说明hTERT基因启动子区CpG岛被检测位点未发生甲基化。

1.6 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计数资料组间比较采用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验组甲基化阳性率为73.3%（11/15），对照组甲基化阳性率为26.7%（4/15），阳性对照组甲基化阳性率为100.0%（3/3）。实验组甲基化阳性率明显高于对照组，差异有统计学意义（P=0.027）。实验组甲基化阳性标本中，上皮性恶性肿瘤10例，未成熟性畸胎瘤1例；手术病理分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期4例，Ⅲ期2例。对照组甲基化阳性标本中，卵巢浆液性囊腺瘤2例，黏液性囊腺瘤1例，成熟性畸胎瘤1例。MSP结果见图1。

3 讨论

研究发现，卵巢肿瘤组织中存在高频率的端粒融合，但是在正常的邻近组织或良性卵巢组织中发现了有限的端粒融合[7]。端粒融合可通过融合点两侧端粒酶外显子表达的改变影响hTERT功能[8]。hTERT为端粒酶的催化蛋白亚单位，与端粒酶有平行关系，为其限速因素，hTERT的转录调节被认为在人类癌症中的端粒酶活化中起主要作用[9]。CpG启动子甲基化是hTERT多种调节途径之一[10]。hTERT CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，hTERT复合物在约80%～90%的恶性肿瘤中具有活性，并受各种因素调节，包括hTERT基因启动子的甲基化状态[11-13]。外周血白细胞中hTERT启动子的高甲基化可作为头颈癌进展的分子标志物[14]。上述结论与本研究中恶性卵巢肿瘤组织中hTERT启动子的高甲基化具有一致性。本研究通过检测卵巢良、恶性卵巢肿瘤组织中hTERT启动子DNA甲基化率的差异，结果显示恶性卵巢肿瘤组织hTERT启动子DNA甲基化率达73.3%，高于卵巢良性肿瘤组织的26.7%，两者比较差异有统计学意义。本研究提示hTERT启动子DNA甲基化与卵巢恶性肿瘤有相关性。

图1 3组实验标本hTERT启动子MSP电泳图（a：阳性对照组3例均可见M条带；b-c：对照组15例中4例可见M条带；d-e：实验组15例中11例可见M条带。M：甲基化引物扩增的条带；U：非甲基化引物扩增的条带）

关于hTERT启动子DNA甲基化与卵巢癌发生、发展的相关机制，国内外已有学者做了大量的研究。在癌症进展过程中，沿着基因体的CpG位点存在全基因组的低甲基化，在基因启动子区域存在CpG岛的高甲基化[15]。hTERT是启动子序列甲基化与基因表达呈正相关的基因，hTERT启动子DNA甲基化与hTERT mRNA和端粒酶活性之间的相关性表明hTERT启动子DNA甲基化可能与hTERT调控有关[16]。研究表明hTERT启动子内特定区域的甲基化，特别是hTERT核心启动子上游的甲基化，与基因激活有关[17]。李红霞等[18]研究发现，hTERT激活与卵巢癌的发生、发展有关。反义hTERT基因治疗能通过抑制端粒酶活性、增强细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡等途径抑制卵巢癌细胞生长[19]。核心启动子是位于转录起始位点附近由100个左右核苷酸所构成的功能区域。本研究采用hTERT核心启动子上游位置的甲基化引物进行扩增，该目标基因片段表达阳性的病例说明存在核心启动子上游的甲基化，根据上游启动子甲基化可引起端粒酶活化这一特点，说明卵巢癌的发生、发展可能因hTERT核心启动子上游的甲基化引起该基因的活化进而引起卵巢癌的进展。关于hTERT启动子DNA甲基化如何导致hTERT活化有以下几种解释：（1）可能是基于因DNA甲基化而阻碍抑制性元件结合。结合因子（CCCTC binding factor，CTCF）与转录起始位点结合并抑制hTERT转录，但DNA甲基化阻止CTCF结合，从而允许端粒酶的激活[20]。（2）Wilms肿瘤蛋白是hTERT表达的抑制因子，其结合位点在癌症中表现出CpG甲基化的增加，导致抑制效应的阻断，从而导致 hTERT 的表达[16，21]。（3）DNA 甲基化可通过影响DNA暴露于转录因子而影响基因表达的染色质构象变化[22]，可能导致与不同因子结合，这些因子可以驱动hTERT在癌症中的表达[23]。对于卵巢癌hTERT核心启动子上游序列甲基化引起端粒酶活化的机制需针对后续卵巢恶性肿瘤组织启动子区的基因测序等研究来进一步探讨。

本研究显示卵巢恶性肿瘤组织中hTERT启动子DNA甲基化较卵巢良性肿瘤组织偏高，作为筛查卵巢恶性肿瘤的检测指标具较高的特异度，其特异度与引物的位点有关系，根据其他学者的研究结论，hTERT启动子上游部位具有更高频的甲基化。本研究仅采用一个位点的引物进行甲基化扩增验证，虽然在恶性卵巢肿瘤组织检测到了hTERT启动子的高甲基化的情况，但在少部分良性肿瘤，也检测到了hTERT甲基化的阳性表达，故不能对比其他位置甲基化引物的扩增是否具有更高的特异性和不同的实验结果，另外本研究实验组及对照组例数偏少，具有局限性，不同位点引物实验的甲基化差异需后续实验来进一步证实。后续需扩大样本量和取多个区段引物进行实验筛选特异度和灵敏度更高的基因位点，并进一步研究甲基化与卵巢癌发生、发展的关系，并为游离血检测早期卵巢恶性肿瘤提供组织学依据。