丹参酮合成相关的SmCYP81C16基因克隆和功能研究

张建红 王喆 陈泓宇 严黎 吕海舟 刘琬菁 徐志超 罗红梅

摘要 目的：丹參（Salvia miltiorrhiza）根中所含的丹参酮为二萜醌类化合物，而鉴定参与丹参酮合成的CYP450基因成为解析丹参酮生物合成途径分子机制的关键步骤。方法：本实验从丹参基因组和转录组数据中筛选到SmCYP81C16基因，采用RT-PCR方法克隆获得基因cDNA全长序列，利用生物信息学分析方法分析其所编码蛋白质的理化性质，预测该蛋白质二级结构、保守结构域等，建立系统发育进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测了该基因的组织/器官表达特异性;通过遗传转化方法获得了该基因的过表达转基因毛状根株系，通过化学检测及代谢组学分析丹参酮类化合物在对照株系和过表达株系中的含量变化。利用实时荧光定量PCR方法检测了毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因中的相对表达量。结果：SmCYP81C16基因全长1 497 bp，编码498个氨基酸残基，该蛋白质相对分子质量为55.8 kDa;SmCYP81C16在丹参茎和根的周皮部高表达;通过化学检测及代谢组学分析发现，与对照株系比较，在SmCYP81C16过表达阳性株系中，丹参酮类化合物的含量升高;过表达毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因的表达量显著上升。结论：本研究结果表明SmCYP81C16具有正向调控丹参酮生物合成的功能。本研究为利用生物技术方法提高丹参酮类化合物含量奠定基础。

关键词 丹参;细胞色素P450;丹参酮;生物合成;基因克隆;生物信息学分析;基因过表达;转基因毛状根

Cloning and Functional Research of SmCYP81C16 Related to Tanshinone Biosynthesis

ZHANG Jianhong1， WANG Zhe2， CHEN Hongyu1， YAN Li1， LYU Haizhou1， LIU Wanjing1， XU Zhichao1， LUO Hongmei1

（1 Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education， Key Lab of Chinese Medicine Resources Conservation， National Administration of Traditional Chinese Medicine of the People′s Republic of China， China Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College， Beijing 100193， China; 2 State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines， Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College， Beijing 100050， China）

Abstract Objective：Tanshinone in Salvia miltiorrhiza root is a diterpene quinone compound.Identification of the CYP450 gene involved in tanshinone synthesis has become a key step in analyzing the molecular mechanism of tanshinone biosynthesis pathway.Methods：SmCYP81C16 was screened from the genome and transcriptome data of S.miltiorrhiza and the full-length cDNA sequence was obtained and cloned by RT-PCR method.Bioinformatics analysis was used to analyze the characteristics of physicochemical properties of the coded protein， to predict the secondary structure， conserved domains， etc.of the protein， to establish phylogenetic tree; real-time quantitative PCR method was used to detect the relative expression specificity of this gene in the tissues/organs of S.miltiorrhiza.The overexpressing transgenic hairy root was obtained by genetic transformation， and the content of tanshinones was analyzed by chemical detection and metabolomics.Real-time quantitative PCR method was used to detect the comparative expression levels of key enzymes in tanshinone biosynthetic pathway in hairy roots.Results：The full-length of SmCYP81C16 was 1 497 bp， encoding 498 amino acid residues.The relative molecular weight of this protein was 55.8 kDa.SmCYP81C16 was highly expressed in the stem and the periderm of S.miltiorrhiza.Through chemical detection and metabolomics analysis， it was found that compared with the control strain， in SmCYP81C16 overexpressing strains， the content of tanshinone compounds increased; the expression level of key enzyme genes of tanshinone synthesis pathway in overexpressing hairy roots increased significantly.Conclusion：SmCYP81C16 has the function of positively regulating tanshinone biosynthesis.This study lays a foundation for improving tanshinone biosynthesis content by using biotechnology.

Keywords Salvia miltiorrhiza; Cytochrome P450; Tanshinones; Biosynthesis; Gene clone; Bioinformatics analysis; Gene overexpression; Transgenic hairy roots

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.009

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，根和根茎入药，是一种传统的具有重要药用价值和经济价值的药用植物[1]。丹参中的丹参酮类化合物在心脑血管疾病治疗方面效果显著[2]，以丹参为君药的“复方丹参滴丸”顺利完成美国食品和药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）III期临床实验，有望成为首例获得美国FDA认证的复方中药。此外，有研究表明，丹参酮I具有显著的抗癌活性[3]，丹参酮II A在抗菌抗炎[4-5]、抗肿瘤[6-7]方面也具有一定疗效。

丹参酮为脂溶性二萜类化合物[8]，包括丹参酮I（Tanshinone I）、丹参酮IIA（Tanshinone IIA）、隐丹参酮（Cryptotanshinone）、二氢丹参酮I（Dihydrotanshinone I）等十余种化合物。丹参酮类化合物通过定位在植物细胞质中的甲戊二羟酸途径（Mevalonate Pathway，MVA）和定位在质体中的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径（2-methyl-D-erythritol 4-phosphate Pathway，MEP）合成丹参酮前体物质牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（Geranylgeranyl Diphosphate，GGPP）。GGPP经二萜合酶柯巴基焦磷酸合酶（Copalyl Diphosphate Synthase，CPS）及类贝壳杉烯合酶（Kaurene Synthase-like，KSL）环化得到二萜类化合物骨架次丹参酮二烯（Miltiradiene）;次丹參酮二烯再经一系列细胞色素P450单加氧酶（Cytochrome P450，CYP450）的修饰作用最终生成丹参酮类化合物[9-12]。由此可见，CYP450与丹参酮类化合物的生物合成过程密切相关，因此，CYP450的基因克隆和功能研究对解析萜类生物合成途径具有重要作用。

CYP450是含有亚铁血红素的一类酶，在细胞中主要分布在内质网和线粒体内膜上，是植物代谢最大的酶家族之一，约占植物基因组编码基因的1%[13]。它作为一种末端加氧酶，具有广泛的催化活性，参与多种生物化学途径，产生初级和次级代谢物如苯丙烷类、生物碱类、萜类、脂类等[14-15]。近年来，对CYP450的结构、功能特别是对其在次生代谢途径中的功能研究取得较大进展。在丹参中，已经鉴定到3个CYP450参与丹参酮生物合成途径：CYP76AH1能够催化次丹参酮二烯合成铁锈醇（Ferruginol）[16];CYP76AH3催化铁锈醇可以同时合成11-羟基铁锈醇（11-hydorx Ferruginol）、柳杉酚（Sugiol）和11-羟基柳杉酚（11-hydorxy sugiol）;CYP76AK1可分别羟基化11-羟基铁锈醇和11-羟基柳杉酚的C20位点生成11，20-二羟基铁锈醇（11，20-hydorx Ferruginol）及11，20-二羟基柳杉酚（11，20-hydorxy Sugiol）[17]。据推测的丹参酮生物合成途径，除了已经鉴定的3个CYP450外，仍有其他CYP450参与丹参酮生物合成过程。

本研究基于Xu等筛选的33个丹参根周皮显著高表达的CYP450[18]，结合已发表的丹参全基因组及转录组信息[19-20]，筛选并克隆到可能参与丹参酮合成的SmCYP81C16;系统分析其进化关系及其表达谱，通过生物信息学预测其编码蛋白质的理化性质及保守结构域等;构建过表达载体，利用发根农杆菌介导的遗传转化方法转化丹参，获得转基因毛状根阳性株系，利用UPLC及代谢组学检测分析技术检测过表达和对照株系中丹参酮类化合物含量变化，有助于进一步验证SmCYP81C16的具体催化功能，为进一步揭示丹参酮类化合物生物合成途径奠定重要基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国，型号：NanoDrop 2000C）;凝胶成像系统（伯乐生命医学产品（上海）有限公司，型号：GelDoc XR+）;电泳仪（北京市六一仪器厂，型号：DYY-8C型）;热循环仪（Thermo Fisher Scientific，美国，型号：9700系列）;实时荧光定量PCR仪（伯乐生命医学产品（上海）有限公司，型号：CFX96）;制冰机（SANYO，日本，型号：Sim-F140）;电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，型号：AL204-IC）;小型台式高速离心机（Thermo Fisher Scientific，美国，型号：Sigma-1-14）;金属浴（北京银金杏生物科技有限公司，型号：DK-8D）;摇床（太仓市实验设备厂，型号：DDHZ-300）;-80 ℃超低温冰箱（Thermo Fisher Scientific，美国，型号：ULT2586-4-V48）;UPLC system BCH C18 column（Waters，美国，1.7 μm，2.1 mm×100 mm）;HPLC-LTQ/FTICR-MS（Thermo Fisher Scientific，美国）。

1.2 试剂 RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP441）、质粒小提试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP103-03）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP209-03）、PrimeScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit（宝日医生物技术（北京）有限公司，货号：6210A）、PyrobestTM DNA Polymerase（宝日医生物技术（北京）有限公司，货号：R005A）、T4 DNA Ligase（宝日医生物技术（北京）有限公司，货号：2011A）、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金生物技术有限公司，货号：CB501-02）、Gateway BP ClonaseTM II Enzyme Mix（Invitrogen公司，美国，货号：11789-020）、Gateway LR ClonaseTM II Enzyme Mix（Invitrogen公司，美国，货号：11791-020）;菌株E.coil DH5α Competent Cells（北京庄盟国际生物基因科技有限公司，货号：ZK206）。

1.3 样品 两年生丹参（S.miltiorrhiza）99-3植物采自中国医学科学院药用植物研究所试验地，于盛花期采集丹参根、茎、叶、花等部位，清水洗净，置于液氮中速冻，并保存于-80 ℃冰箱中备用。

2 方法与结果

2.1 RNA提取和cDNA合成 取丹参不同部位的样品，置于研钵中，液氮研磨至均匀粉末，依据天根生化科技（北京）有限公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的操作步骤提取丹参总RNA，利用NanoDrop2000进行含量测定以及1%的琼脂糖电泳检测RNA完整性。利用无RNA酶的脱氧核糖核酸酶（DNase I）对提取的RNA进行处理，去除RNA提取物中所含的DNA;再利用宝日医公司的PrimeScriptTM II 1st strand cDNA合成试剂盒，按照提供的反应条件和步骤将RNA反转录成第一链互补链DNA（cDNA）。

2.2 SmCYP81C16基因克隆及生物信息学分析 基于丹参基因组中的SmCYP81C16基因全长序列，设计基因全长扩增的特异引物SmCYP81C16-F/R，引物序列见表1。使用TaKaRa公司的Pyrobest DNA聚合酶扩增SmCYP81C16基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收后连接pEASY-Blunt Zero载体进行测序。将克隆到的正确序列使用Softberry（http：//linux1.softberry.com/）提供的FGENESH工具进行基因序列分析，得到基因结构和编码的蛋白质序列。使用SOMPA在线网站进行蛋白二级结构分析。通过ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）进行蛋白质理化性质预测，在InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/）在线工具中进行同源搜索，预测蛋白的保守结构域。通过Swiss-model（https：//swissmodel.expasy.org/）进行三维同源建模。

丹参酮合成途径研究较为深入，SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1是丹参酮合成途径的关键酶[16-17]，SmCYP71D375也参与了丹参酮合成途径[21]。另外，在NCBI中下载搜索其他植物中已经鉴定功能的CYP450蛋白序列，通过Clustal W方法对所选蛋白序列进行序列比对，在MEGA6中使用邻接法（Neighbour Joining Method）构建系统进化树。

2.3 构建过表达载体 设计SmCYP81C16基因全长的过表达（Over-expression，OE）引物，根据Gateway原理在引物前添加attB序列，所用引物名称为：SmCYP81C16-OEF/R，引物序列见表1。以重组质粒pEASY-SmCYP81C16OE为模板，使用SmCYP81C16-OEF/R引物进行PCR扩增。将PCR产物回收，再将回收产物进行BP反应，BP反应体系：25 ng attB-PCR回收产物，75 ng pDONR221入门载体，1 μL LR clonase II enzyme，补充ddH2O至5 μL。将其反应连接产物转化DH5α感受态细胞，用含50 mg/L Kan（卡那霉素）的LB固体培养基筛选培养，回收pDONR221-OE重组质粒进行LR反应;LR反应体系：75 ng pDONR221-OE回收产物，75 ng pK7WG2D受体载体，1 μL LR clonase II enzyme，补充ddH2O至5 μL。反应连接产物转入DH5α感受态细胞，取200 μL菌液涂布于含50 mg/L Spec（壮观霉素）的LB固体培养基筛选培养，菌落PCR检测后选择阳性菌株送公司测序;取测序正确的克隆提取重组质粒pK7WG2D-SmCYP81C16，将重组质粒（pK7WG2D-SmCYP81C16）和空载体（pK7WG2D）分别转入发根农杆菌ACCC10060中，分别获得SmCYP81C16的过表达毛状根株系（C16oe）和对照株系（pkoe）。

2.4 侵染丹参叶片 取生长旺盛的丹参组培苗幼嫩叶片，剪切成0.5 cm2大小的叶盘于MS培养基25 ℃预培养2 d。将转化得到发根农杆菌ACCC10060 28 ℃培养于含50 mg/L Spec+50 mg/L Rif（利福平）的液体YEB培养基，28 ℃振荡培养至OD600达到0.4～0.6，使用MS培养基重悬菌体，侵染丹参叶盘后将叶盘置于MS平板上，25 ℃黑暗条件下共培养48～72 h。将共培养的叶盘分别用无菌水和含500 mg/L Car（羧苄青霉素）的无菌水洗干净后，置于含500 mg/L Car+50 mg/L Kan的MS平板上，25 ℃黑暗条件下筛选培养，选择长势良好的毛状根，待其生长至2.0～3.0 cm后切下，置于含200 mg/L Car+15 mg/L Kan+0.1 mg/L IAA的6，7-V固体培养基上刺激一周后转接至不含IAA的固体培养基，待长出较多侧根后，使用荧光显微镜检测载体质粒含有的标签蛋白——绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，判断转基因毛状根是否为阳性株系。将选择的2株阳性株系标记为C16oe-4、C16oe-6转接至6，7-V液体培养基中继续培养。

2.5 丹参SmCYP81C16基因表达分析 取液体培养基中培养了1个月的只转化了空载体的对照株系（pkoe）和转化了SmCYP81C16过表达质粒的株系（C16oe），以及丹参根（R）、茎（S）、叶（L）、花（F）、周皮（R1）、韧皮部（R2）和木质部（R3），分别提取总RNA，再将这些RNA反转录为cDNA。挑选SmCYP81C16基因特异性片段设计实时定量PCR（qRT-PCR）引物：SmCYP81C16-qF/R，引物序列见表1。以丹参SmACTIN（HM231319.1）作为内参基因，制备qRT-PCR体系：2×SYBR Premix Ex Taq II 2.5 μL，cDNA模板1 μL，引物各1 μL，RNase-free ddH2O 4.5 μL。qPCR反應条件为95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。65～95 ℃时做熔解曲线，收集Ct值，以2-△△Ct方法[22]计算不同样品间该基因相对表达量，每个样品设3个生物学重复。

2.6 UPLC检测转基因毛状根中丹参酮类化合物含量 毛状根在液体培养基中震荡培养4个月后取出拍照，烘干后称重，使用球磨仪打粉，每100 mg毛状根用0.5 mL甲醇提取，提取物超声处理30 min，8 000 r/min离心10 min，用0.22 μm尼龙过滤器将上清过滤至棕色液相小瓶中，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm;Waters）;检测波长，255 nm;柱温，25 ℃;流速，0.25 mL/min;进样量，2 μL，流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱条件为20%～60% A（0～5 min），60%～70% A（5～20 min），70%～80% A（20～25 min），80%～100% A（25～26 min），100% A（26～30 min）。記录各化合物的峰面积，每个样品设3个生物学重复。

2.7 代谢组学分析转基因毛状根中丹参酮类化合物含量 将丹参样本在液氮冷冻下粉碎研磨成粉末后，精密称取上述样品约200 mg置于10 mL具塞玻璃离心管中，加入2 mL 75%甲醇和100 μL内标溶液，封口膜封好瓶盖，涡旋60 s，超声提取60 min（功率140 W，频率42 kHz），4 500 r/min离心10 min后，取上清液过0.22 μm微孔滤膜后进样分析。色谱条件：色谱柱：Agilent Zorbax SB C18柱（100×2.1 mm，3.5 μm）;流动相：乙腈（A），0.1%甲酸水溶液（B）;流速：0.3 mL/min;柱温：35 ℃;进样量：10 μL;检测波长：220 nm、360 nm;梯度洗脱：0～10 min，5%～15%A;10～40 min，15%～35%A;40～50 min，35%～65%A;50～55 min，65%～100%A;55～56 min，100%～5%A;56～60 min，5%A。质谱条件：离子源：ESI;检测模式：正离子;喷雾电压：4.2 kV;鞘气（N2）流速：40 arb;辅助气（N2）流速：15 arb;吹扫气（N2）流速：3 arb;毛细传输管电压：42 V;毛细传输管温度：275 ℃;锥孔电压：106 V;扫描方式：FT全扫描（Full Scan）;扫描范围：m/z 100～2 000 Da;分辨率：50 000;MSn采用LTQ全扫描（Full Scan）方式进行扫描，通过数据依赖扫描（data dependent scan）模式对最强和次强的离子进行碰撞诱导解离（CID）;CID分辨宽度为2 Da;碰撞能量：35%;碰撞气：高纯氦气（He）。数据采集采用Xcalibur 2.0 SR2（Thermo Fisher Scientific）软件。

2.8 转基因毛状根中丹参酮生物合成途径关键酶基因的表达量检测 设计丹参酮生物合成途径中的关键酶基因DXS2、CPS1、KSL1、CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1的特异性片段扩增引物，利用实时荧光定量PCR方法，检测这些基因在转基因毛状根株系和对照株系中的相对表达量，以丹参SmACTIN（HM231319.1）作为内参基因，采用2-△△Ct方法计算基因的相对表达量。丹参酮生物合成途径中的关键酶基因的引物见表2。

2.9 结果

2.9.1 SmCYP81C16基因克隆及其编码的蛋白质理化性质预测分析 利用RT-PCR方法克隆得到SmCYP81C16基因全长1 497 bp，编码498个氨基酸残基，二级结构在线预测结果表明，SmCYP81C16蛋白的二级结构中α-螺旋占48.59%，β-折叠占4.02%，延伸链占11.24%，无规卷曲占36.14%。通过ExPASy对该蛋白进行理化性质进行预测分析，结果表明该蛋白相对分子质量为55.8 kDa，理论等电点为8.32。通过Interpro进行同源搜索，预测蛋白保守结构域，其结果显示该蛋白在Inerpro数据库中的同源序列为IPR001128。见图1。预测该蛋白在5～27位氨基酸为跨膜螺旋结构。通过SWISS-MODEL对其进行3D同源建模，模型以5ylw.1.A为模板构建，模板蛋白质与SmCYP81C16蛋白质序列的序列同源性可达33.68%，覆盖率为91.9%。见图2。

2.9.2 系统发育进化分析 将SmCYP81C16蛋白质序列与其他CYP450蛋白质序列进行系统发育进化分析，所选序列为：丹参中的SmCYP76AH1（JX422213）、SmCYP76AH3（KR140168）、SmCYP76AK1（KR140169）和SmCYP71D375（AWD93836），人参（Panax ginseng C.A.Mey）中的PgCYP716A47（JN604537）和PgCYP716A53v2（JX036031），水稻（Oryza sativa L.）中的OsCYP99A3（LOC4335091）、OsCYP701A8（LOC4341343）作为参考序列，共同构建系统发育进化树，见图3，结果显示SmCYP81C16与SmCYP71D375亲缘关系最为相近。

2.9.3 SmCYP81C16的表达谱分析 利用SmCYP81C16的qRT-PCR的引物，以2年生丹参的根（R）、茎（S）、叶（L）、花（F）、周皮（R1）、韧皮部（R2）和木质部（R3）的cDNA为模板，检测了该基因在丹参不同组织/器官中的表达特点。结果表明，该基因在丹参的茎（S）和根的周皮部（R1）中显著高丰度表达，在叶中的表达量最低。见图4。

2.9.4 SmCYP81C16过表达转基因毛状根获得 将含有SmCYP81C16基因的质粒转入发根农杆菌（ACCC10060）最终获得转基因毛状根。利用qRT-PCR方法检测了不同转基因毛状根株系中SmCYP81C16的相对表达量，与对照株系比较，过表达株系C16oe-4和C16oe-6中基因的过表达倍数分别为2.34倍和92.9倍，如图5A所示，表明已成功获得该基因的过表达毛状根株系;SmCYP81C16过表达的转基因毛状根和对照株系中的毛状根示于图5B，可见这些毛状根的生长发育正常，无表型差异。

2.9.5 转基因毛状根中丹参酮类化合物含量检测筛选出的丹参转基因阳性毛状根在液体培养基中震荡培养4个月后，拍照，见图5B，UPLC检测发现，与对照株系比较，二氢丹参酮Ⅰ，见图6A、隐丹参酮，见图6B、丹参酮Ⅰ，见图6C和丹参酮ⅡA，见图6D的含量在SmCYP81C16过表达的C16oe-4毛状根株系中均呈上升趋势，在C16oe-6株系中变化不明显。见图6。

2.9.6 SmCYP81C16转基因毛状根代谢组学分析利用高效液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪对丹参转基因毛状根进行化学成分检测，与对照株系比較，二氢丹参酮Ⅰ，见图7A、隐丹参酮，见图7B、丹参酮Ⅰ，见图7C、丹参酮ⅡA，见图7D、丹参酮ⅡB，见图7E、丹参酸甲酯，见图7F和柳杉酚，见图7H的含量在C16oe-4株系中含量显著升高，鼠尾酮，见图7G的含量在C16oe-4和C16oe-6株系中呈升高趋势。其中在C16oe-4株系中，柳杉酚，见图7H含量是对照组的3.39倍，以上数据为SmCYP81C16参与丹参体内丹参酮的生物合成提供依据。

2.9.7 SmCYP81C16转基因毛状根中丹参酮生物合成途径关键酶基因的表达量检测 实时荧光定量PCR检测发现，与对照株系比较，丹参酮生物合成途径关键酶基因DXS2（脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因），见图8A、CPS1，见图8B、KSL1，见图8C、CYP76AH1，见图8D的表达量在过表达毛状根中均显著提高。其中C16oe-4和C16oe-6株系中DXS2的基因表达量是对照的4.34和12.70倍，见图8所示。CYP76AH3，见图8E和CYP76AK1，见图8F只在C16oe-6中显著高于对照株系，但在C16oe-4株系中与对照株系比较，变化不明显。

3 讨论

随着分子生物学以及本草基因组学[23-24]相关理论和技术的不断发展，CYP450在次生代谢途径中的功能正在逐步得以验证。近年来，利用异源表达和RNA干扰等技术相继在人参[25]、黄花蒿（Artemisia annua Linn.）[26]等多种药用植物中鉴定出参与次生代谢途径的CYP450。在丹参酮生物合成途径中，目前只鉴定了3个参与丹参酮类化合物结构修饰的CYP450基因：CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1，仍有若干参与丹参酮合成的CYP450基因有待于鉴定。本研究通过对于丹参基因组[19]以及转录组[20]数据库的分析，筛选并克隆丹参酮生物合成途径的候选基因，为丹参酮生源途径的解析提供参考。

Xu等[18]证实丹参根周皮是丹参酮合成和积累的主要部位，丹参酮生物合成途径关键酶编码基因在根及根周皮中显著高表达。本研究检测发现SmCYP81C16在丹参的周皮部高丰度表达，系统发育进化树分析发现，SmCYP81C16与SmCYP71D375亲缘关系最为相近，SmCYP71D375被证实在丹参体内催化丹参酮的生物合成[21]，表明SmCYP81C16可能参与丹参酮的生物合成。进一步通过转基因毛状根、UPLC和代谢组学等实验技术对其功能进行鉴定，研究发现SmCYP81C16过表达的转基因丹参毛状根中4种主要的丹参酮类化合物的含量与对照相比呈升高趋势，在C16oe-4株系中较明显，在C16oe-6株系中不明显，可能与转基因毛状根不同株系的稳定性不一样有关。同时，检测了在SmCYP81C16过表达的转基因毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因的表达量变化，与对照株系相比，发现关键酶基因表达量均呈上升趋势，此结果为SmCYP81C16在丹参体内催化丹参酮的生物合成提供证据。

本研究推测SmCYP81C16具有正向调控丹参酮生物合成的作用，但其具体催化底物及催化产物仍未知，后期将通过体外酶促反应来进一步证实和解析SmCYP81C16催化丹参酮生物合成的机理，为丹参酮生物合成途径的解析奠定基础。

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（2020-02-10收稿 责任编辑：徐颖）