补阳还五汤对局灶性缺血模型大鼠认知能力及PI3/KAKT信号通路的影响

董元 王志胜 张金 张兆鹏 刘玉莹 李萍

摘要 目的：观察补阳还五汤对局灶性缺血模型大鼠认知能力的改善作用，同时探讨其对PI3K-AKT信号通路的影响。方法：选取30只SD大鼠按数字随机法分为假手术组、模型组及中药组，每组10只。模型组及中药组接受改良急性局灶性缺血模型制备（MCAO术）成模后中药组大鼠接受补阳还五汤灌胃，1次/d，连续干预14 d。假手术组及模型组大鼠接受等剂量的生理盐水灌胃，时间同中药组。干预结束后，比较各组行为学、脑梗死体积、海马形态学、脑组织PI3K、Akt、p-Akt蛋白/mRNA水平變化。结果：补阳还五汤可明显缩短大鼠游泳轨迹路程及逃避潜伏期，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;补阳还五汤可缩小MCAO大鼠的脑梗死体积，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;补阳还五汤可减少MCAO后大鼠海马组织病理损伤征象，上调PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白及mRNA表达，降低Bax蛋白及mRNA水平，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：补阳还五汤可改善MCAO大鼠认知能力，其作用机制可能与介导PI3K-AKT信号通路有关。

关键词 局灶性缺血;模型大鼠;补阳还五汤;认知;水迷宫;脑梗死体积;PI3K-AKT信号通路;机制

Effects of Buyang Huanwu Decoction on Cognitive Ability and the PI3/KAKT Signaling Pathway in Model Rats with Focal Ischemia

DONG Yuan，WANG Zhisheng，ZHANG Jin，ZHANG Zhaopeng，LIU Yuying，LI Ping

（Sunshine Union Hospital，Weifang 261000，China）

Abstract Objective：To observe improvement effect of Buyang Huanwu Decoction in cognitive ability of focal ischemia model rats and explore its effects on the PI3K-AKT signaling pathway.Methods：A total of 30 SD rats were randomly divided into sham operation group（n=10），model group（n=10）and Chinese materia medica group（n=10）.The rats in the model group and the Chinese materia medica group received modified acute focal ischemia modeling（MCAO）.After the modeling，the rats in the Chinese materia medica group received intragastric administration of Buyang Huanwu Decoction once a day for 14 d.The rats in the sham operation group and the model group were given the same dose of normal saline for the same time as the Chinese materia medica group.After the intervention，behavior，volume of cerebral infarction，morphology of hippocampus and levels of PI3K，Akt and p-Akt protein/mRNA in brain tissue were compared in each group.Results：1）Buyang Huanwu Decoction could significantly shorten the swimming track and escape latency of rats，and there was significant difference compared to that in the model group（P<0.05）.2）Buyang Huanwu Decoction could reduce the cerebral infarction volume of MCAO rats，and there was significant difference compared to that in the model group（P<0.05）.3）Buyang Huanwu Decoction could reduce pathological injury signs of hippocampal tissue after the MCAO，up-regulate the expressions of PI3K，p-Akt，Bcl-2 protein and mRNA，and decrease the levels of Bax protein and mRNA，which were significantly different from those in the model group（P<0.05）.Conclusion：Buyang Huanwu Decoction can improve the cognitive ability of MCAO rats，and its mechanism may be related to mediating the PI3K-AKT signaling pathway.

Keywords Focal ischemia; Model rats; Buyang Huanwu Decoction; Cognition; Water maze; Cerebral infarction volume; PI3K-AKT signaling pathway; Mechanism

中图分类号：R289.5;R543文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.014

脑卒中具有极高的死亡率及致残率，是脑组织血液循环障碍性疾病，随着现代医学水平的逐年提高，脑卒中的死亡率在逐年下降，但仍有接近80%的患者遗留明显的神经功能缺损[1-3]，其中认知障碍是重要的后遗症之一，影响患者康复训练的依从性，阻碍康复。中医在治疗脑卒中方面的优势有目共睹，其分为气虚血瘀、痰瘀阻络、肝肾亏虚等证型，其中气虚血瘀临床发病率最高[4-6]。补阳还五汤是经典伤寒经方，数百年来均广泛运用于中风病及其相关后遗症的治疗，目前临床资料显示该汤剂可有效治疗气虚血瘀型脑卒中[7-9]，但其作用机制目前尚不明了。PI3K-AKT信号通路示迄今为止最重要的细胞凋亡相关性通路[10-12]，大量脑保护因子通过介导PI3K-AKT信号通路而产生疗效。我们将MCAO大鼠作为研究对象，对其进行补阳还五汤干预，并检测PI3K-AKT信号通路标志性蛋白水平的变化，以期进一步完善补阳还五汤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选取6周龄的雄性SPF级的SD大鼠30只纳入研究，体质量230～250 g，平均体质量（215±9.38）g，均购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：2007000509960，许可证号：SC-SCXK（沪）2007-0005，饲养于本院动物实验中心。

1.1.2 试剂与仪器

电泳凝胶成像分析系统（Bio-Rad，型号：ChemiDocXRS+，购自上海伯乐生命医学产品有限公司），BCA蛋白检测试剂盒（西安晶彩生物科技有限公司，批号28392），SDS-PAGE电泳凝胶试剂盒（购自碧云天生物公司，批号A293）、PI3K单克隆一抗抗体（美国CST公司，批号17366S）、Akt单克隆一抗抗体（美国CST公司，批号4685S）、p-Akt单克隆一抗抗体（美国CST公司，批号：4060T）、Bcl-2单克隆一抗抗体（美国CST公司，批号15071T），Bax单克隆一抗抗体（美国CST公司，批号5023T），β-actin抗体（美国CST公司，批号3700T）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

将30只大鼠随机数字法分为假手术组、模型组及中药组，每组10只。各组大鼠在体质量、鼠龄等方面比较差异无统计学意义（P>0.05）。具有可比性。其中模型组及中药组大鼠参照改良的Zea Longa线栓法进行MCAO模型的制备[6]：所有大鼠适应性喂养7 d，造模前动物禁食不禁水，参照改良的Zea Longa线栓法进行MCAO模型的制备[10]。采用10%水合氯醛以0.3 mL/kg比例进行腹腔注射麻醉，颈部正中切口，钝性分离皮下组织，逐渐分离出右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）及颈内动脉（ICA），将ECA近心端结扎，于CCA处（距离ECA、ICA交叉口0.5 cm）做一大小约0.25 mm切口，线栓经ICA插进去至大脑中动脉入口，长18～20 mm，随后将线栓固定于CCA，随后缝合皮肤，将线栓尾部暴露于皮肤外，2 h后轻轻拔出线栓。假手术组大鼠仅进行麻醉及分离血管后缝合皮肤。实验过程中大鼠保温（24 ℃）喂养，自由摄食饮水。

1.2.2 给药方法

中药组大鼠在造模第二天开始接受补阳还五汤灌胃治疗：赤芍12 g、川芎12 g、当归尾9 g、地龙9 g、黄芪30 g、桃仁9 g、红花9 g。水煎，剂量按照按人/鼠公斤体质量的等效剂量计算，1次/d，连续干预7 d。模型组及假手术组以等体积生理盐水灌胃。

1.2.3 检测指标及方法

水迷宫：将各组大鼠于造模前及干预后进行Morris水迷宫实验，將水迷宫池（规格：直径2.0 m），高0.5 m，水深0.3 m水温（25±2）℃，将水迷宫池分为4等距离点象限，选定第一象限后将直径6 cm的平台放置于低于水平面2 cm处的中央位置，设置为水迷宫定位航行平台，将大鼠于第一象限放入水中，记录其寻找平台的游泳轨迹以及时间（逃避潜伏期）。

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色：预结束后从各组大鼠中随机选取3只大鼠，麻醉处死后冰上将大鼠脑袋迅速取出，并将脑袋置于-20 ℃冰箱中冰冻30 min，随后沿着冠状面将脑组织切成6个薄片，每个薄片厚度约2 mm，将切好的脑组织薄片浸泡于TTC溶液中，避光条件下反应，每2 min用毛笔翻动脑片1次，让TTC溶液充分接触脑片使其充分染色，反应结束后将脑片轻轻置于带有刻度的平台上，用高分辨率相机拍摄（佳能powershot 600X），使用Image-Pro Plus图像分析处理系统（Motic Med 6.0 System）计算每片脑梗死体积。

HE染色：干预结束后从各组大鼠中随机选取3只大鼠，麻醉脱颈处死后将事先配制好的多聚甲醛溶液从下腔静脉灌流固定，随后取出海马组织浸泡于4%甲醛溶液，梯度乙醇进行脱水，再用二甲苯进行透明组织，将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，再将蜡块切成薄片，捞片后将组织置于45 ℃恒温箱中烘干，再用二甲苯、梯度乙醇脱蜡，再用苏木精染色15 min，再用伊红染色数秒，随后再次用梯度乙醇及二甲苯处理后利用中性树胶封片，光学显微镜下观察海马组织的病理结构。

Western blotting检测：干预结束后从各组大鼠中随机选取3只大鼠，麻醉处死后冰上将大鼠脑袋迅速取出，并分离出海马组织，加入1 mL的RIPA裂解液和10 μL PMSF进行组织裂解，充分反应后将样本置于4 ℃，12 000×g分离15 min，吸取上清液后加入4X蛋白上样缓冲液，在金属浴仪中进行蛋白变性7 min，将样品加入至事先配制好的SDS-PAGE电泳凝胶内，总蛋白两30 μg、电泳结束后将目标蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），转膜后用脱脂奶粉封闭2 h，用0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗干净后分别加入PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax以及β-actin一抗抗体，4 ℃下孵育24 h，次日取出PVDF膜后用TBST清洗3次，10 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000）室温下孵育1 h，加入ECL溶液，反应1 min后进行曝光扫描，用Image J软件扫描条带灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）来描述，组间比较采用两样本t检验或两样本秩和检验;组内比较采用配对t检验或配对秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠游泳轨迹和逃避潜伏期比较

与假手术组比较，模型组及中药组大鼠游泳轨迹和逃避潜伏期延长，其中中药组较模型组改善明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1及图1。

2.2 各组脑梗死体积比较

假手术组未见脑梗死病灶，模型组和中药组可见明显脑梗死病灶（表现为苍白色区域），中药组干预后的脑梗死病灶体积百分比明显小于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 各组海马组织病理结构比较

假手术组组织结构正常，细胞排列整齐，模型组海马组织细胞排列紊乱，大量的坏死神经元细胞，部分存活的神经元细胞明显缩小;中药组大鼠海马组织细胞排列较模型组整齐，仅有部分细胞排列散乱，部分神经元细胞出现坏死征象，大部分神经元细胞体积大与模型组。见图2。

2.4 各组Western blotting结果

Western blotting显示造模后大鼠脑组织PI3K、p-Akt、Bcl-2表达降低，Bax水平减少，经过补阳还五汤干预后上述指标有所恢复，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3及图3。

3 讨论

脑卒中是临床发病率极高的高血管事件种类，其中缺血性脑卒中占近75%，是脑卒中的主要类型，因此研究缺血性脑卒中的治疗方案具有重要临床意义。在过去数十年间，全球近200种药物进入脑卒中治疗的临床实验，但仅有组织型纤维蛋白溶活剂（tissue-type Plasminogen Activator，tPA）获得美国国家食品药品管理局批准应用于临床治疗，但有数据显示仅有3%～5%的患者对tPA显示出临床敏感性[13-14]。高达95%～97%的缺血性脑卒中患者目前未有确实有效的治疗药物，形势非常严峻。研究人员认为，目前缺血性脑卒中疗效不尽人意的主要原因有[15-16]：神经保护类药物作用机制过于单一;缺血性脑卒中后神经修复时间窗短。因此具有较长作用“时间窗”的多靶点的神经保护类药物将是研发缺血性脑卒中药物的关键。本研究利用补阳还五汤对MCAO大鼠进行干预，结果显示补阳还五汤可明显改善缺血性脑卒中后大鼠的认知能力，同时缩小其脑梗死组织的区域，并改善了海马的组织结构。

中医学认为人之一身离不开气血，《黄帝内经》云：“人之所有者，血与气耳”“气血不和，则百病乃变化而生”。由此可见，气血是诸病之主因。气虚、气滞则血运失常而致瘀血内生，而瘀血亦可加重气机运行不畅，恶化气虚之证，二者互为因果。早在《黄帝内经》即已记载正气亏虚，风邪趁虚而入，瘀血阻络而成中风;东汉张仲景亦以“内虚邪中”解释中风病病机，故认为治疗“本气自虚”是本病的主要治则。《诸病源候论》中写到：“风半身不遂者，脾胃气弱，血气偏虚”。故从气血亏虚研究中风的发生发展具有理论依据。刘完素亦认为“人卒中，则气血不通而偏枯也”，所以气血运行不畅是偏枯的缘由。王清任认为人之气血分为十，若气血亏虚至五时则半身无气，气虚则血瘀，停滞脉络，必然出现偏瘫之证，故其创立了大补元气、活血化瘀通络的补阳还五汤。方中黄芪为君药，具有益气健脾、升阳举陷、益衛固表、利尿消肿、托毒生肌之功，是大补元气之要药，气足则血行[17-18]。当归主要入心、肝、脾经，有补血活血之功，是补血之圣药，《医学启源》云：“当归，气味温甘，能和血补血，尾破血，身和血”。故本方用当归尾以奏活血化瘀之功。桃仁、红花均可活血化瘀，瘀去则新血生，正如《本草汇言》有载“红花，破血、行血、活血、调血之药也”。川芎乃“血中之气药”，可行气活血散瘀，《神农本草经》记载：“主中风入脑头痛、寒痹，筋脉缓急”。可见川芎亦为只要中风诸证之要药[19]。赤芍微苦，有散瘀止痛之功，地龙善走串于经络间，有通络、息风之功，与黄芪、当归、川芎诸药合用，可加强祛瘀通络之功[20]。本研究通过动物实验再次确认补阳还五汤确对脑中风具有理想的疗效，其可明显改善大鼠的认知能力。

本研究发现PI3K-Akt信号通路的标志性蛋白水平发生了变化，补阳还五汤上调PI3K、p-Akt、Bcl-2的表达水平，降低Bax的水平，这提示补阳还五汤对MCAO大鼠的神经保护效应可能与抗凋亡通路有关。缺血性脑卒中的发病机理复杂，但大部分病理过程与细胞的异常凋亡关系密切，PI3K-Akt信号通路是凋亡相关的重要生物学通路[10-11]。PI3K是脂质激酶，磷酸化后生成磷脂酰肌醇磷酸，促使Akt移聚至细胞膜上引起其构象改变，Akt是PI3K下游的靶向因子之一，PI3K通过磷酸化作用使其Ser473位点效应产生改变，对Akt进行联级活化，发生核移位，影响大量转录子调节器和因子，其中包括Bcal-2及Bax等。有数据显示PI3K-Akt信号通路对神经突触的生长及其可塑性关系密切，从而影响学习、记忆等认知功能的改变，本研究亦证实了这一观点。

总之，补阳还五汤可改善局灶性缺血模型大鼠认知能力，其作用机制可能与介导PI3K-AKT信号通路有关。

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（2019-07-20收稿 责任编辑：杨觉雄）