子宫颈癌中miR-153和Survivin的表达及其临床意义

周成友，杜 阳，赵 静，李 良

子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，在发展中国家的发病率较高[1]。近年子宫颈癌的发病趋势逐渐年轻化，且早期无明显体征，病变发展至晚期全身会出现衰竭症状，严重影响患者的生活质量，因此有效的早期筛查和诊断危险因素可预防子宫颈癌变，并为后期及时治疗提供依据[2]。Survivin是位于17号染色体q25区的生存素，众多学者认为其有望成为肿瘤治疗的靶点[3]；miRNA是一类长约22个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与生物体细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等多种关键调控，其异常表达与子宫颈癌、卵巢癌等妇科肿瘤的发生、发展密切相关[4-5]。目前，miRNA具体作用机制尚未明确[6]。miR-153和Survivin在子宫颈癌组织中的作用机制及相关性尚未见报道，本实验检测子宫颈癌和正常子宫颈组织中miR-153、Survivin的相对表达量，分析两者之间的关系及其与子宫颈癌临床病理特征的关系，为子宫颈癌分子筛查、诊断、治疗及预后评估提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集2011年1月～2016年1月在我院行手术切除并经病理确诊的50例子宫颈癌组织标本，患者年龄30～71岁，平均(50.40±12.23)岁；按2018国际妇产科联盟(FIGO)标准分期：Ⅰ期7例，ⅡA期6例，ⅡB期13例，Ⅲ期24例；肿瘤直径≥4 cm者30例，<4 cm者20例；肿瘤类型：内生结节型27例，菜花型23例；无淋巴结转移者17例，有淋巴结转移者33例。另选取40例因子宫肌瘤行子宫切除患者的正常子宫颈组织作为对照组，患者年龄30～73岁，平均(49.10±13.06)岁。两组患者临床资料差异无统计学意义(P>0.05)。

纳入标准：(1)经组织活检及术后病理检查确诊为子宫颈癌患者，且均确诊为鳞癌；(2)术前均未服用抗肿瘤药物或接受任何放、化疗患者；(3)病理和随访资料完整者；(4)均未合并其他肿瘤或癌前病变者。排除标准：(1)肝、肾等重要器官功能严重不全者；(2)合并其他恶性肿瘤或感染性疾病者；(3)非HPV病毒感染的子宫颈癌患者；(4)术后3年内失访者。

1.2 主要试剂All-in-one miRNA qRT-PCR Detection Kit 试剂盒、PCR引物，均购自奥科生物公司；Recover All Total Nucleic Acid Isilation Kit for FF-PE脱蜡试剂盒，购自Thermo fisher SCIENTIFIC公司；兔抗人Survivin多克隆抗体，购自北京中杉金桥公司；PBS溶液，购自北京中杉金桥公司；二氨基联苯胺显色剂及载玻片，均购自武汉博士德公司。

1.3 方法

1.3.1RT-PCR 采用RT-PCR法检测转染效果，Trizol法提取组织中的总RNA，按照RecoverAll Total Nucleic Acid Isilation Kit for FF-PE脱蜡试剂盒说明书步骤提取核酸，按All-in-one miRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒说明书步骤制备逆转录反应体系。所有引物均由奥科生物公司设计合成，用2-ΔΔCt法计算miR-153的相对表达量。

1.3.2免疫组化 采用免疫组化SP法染色，取各组标本制作石蜡切片，按常规方法脱蜡、包埋、切片。将切片置于0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)中加热修复抗原15 min，取出用0.01 mol/L PBS溶液冲洗3次；加入3%过氧化氢溶液孵育25 min，再用PBS溶液冲洗5次；加入5%山羊血清，室温封闭10 min，滴加Survivin一抗置于4 ℃冰箱中过夜；次日PBS冲洗3次，滴加Survivin二抗室温孵育30 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵蛋白工作液孵育30 min，PBS冲洗3次。二氨基联苯胺显色，苏木精复染，脱水、透明和封固，置于镜下观察。另以空白PBS液作阴性对照。

1.4 结果判断随机观察每张切片10个高倍镜下不重复视野，根据细胞染色程度和染色细胞的百分率进行综合评分。根据细胞染色强度计分：无着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分；根据阳性细胞百分率计分：<10%为0分，10%～40%为1分，41%～70%为2分，>70%为3分；将上述两项得分相加：总分≥2分为高表达，反之为低表达。

1.5 随访对子宫颈癌患者随访3年，在我院长期治疗的患者复查详细病理资料，未在本院进行复查的患者采用电话随访进行联系，主要记录分析对象的总生存时间。

2 结果

2.1 子宫颈癌和正常子宫颈组织中miR-153、Survivin的表达本组结果显示：miR-153在子宫颈癌组织中的相对表达量明显低于正常子宫颈组织，而Survivin在子宫颈癌组织中的相对表达量明显高于正常子宫颈组织，差异均有统计学意义(t=16.333、t=6.407，P均<0.01，表1)；免疫组化染色可见Survivin蛋白表达主要位于基底层细胞(图1)；通过散点图及相关性分析，发现子宫颈癌组织中miR-153和Survivin的相对表达量呈负相关，差异有统计学意义(P<0.01，图2)。

表1 子宫颈癌和正常子宫颈组织中miR-153、Survivin的表达

图1 A.子宫颈癌组织中Survivin的表达，SP法；B.正常子宫颈组织中Survivin的表达，SP法

图2 子宫颈癌组织中miR-153、Survivin表达的相关性

表2 miR-153、Survivin表达与子宫颈癌临床病理特征的关系

2.2 miR-153、Survivin表达与子宫颈癌临床病理特征的关系子宫颈癌中miR-153、Survivin的表达与患者年龄、肿瘤大小、TNM分期均无关(P>0.05)，与淋巴结转移明显相关(χ2=6.455，χ2=5.937，P均<0.05，表2)；且通过散点图及相关性分析，发现淋巴结转移者其受侵数目与miR-153表达量之间呈负相关，与Survivin表达量之间呈正相关，差异均有统计学意义(P<0.01，图3)。

图3 A.子宫颈癌中miR-153表达与淋巴结转移数目的相关性；B.子宫颈癌中Survivin表达与淋巴结转移数目的相关性

2.3 miR-153、Survivin表达与子宫颈癌患者预后的关系随访50例子宫颈癌患者3年，无失访，随访率为100%。miR-153高表达患者生存率(73.33%)明显高于低表达患者(45.71%)；Survivin高表达患者生存率(45.95%)明显低于低表达患者(76.92%)，差异有统计学意义(χ2=19.390，χ2=27.921，P均<0.001，图4)。

图4 A.子宫颈癌中miR-153表达与患者3年生存率的关系；B.子宫颈癌中Survivin表达与患者3年生存率的关系

3 讨论

近年受病毒感染、生物学因素、分娩次数及其他众多因素的影响，子宫颈癌的发病趋势呈逐年上升趋势，但其发病机制尚不清楚。研究表明，众多基因、蛋白均会参与子宫颈癌的发生、发展[7-10]，且miRNA的异常表达与妇科肿瘤的抑癌或促癌关系密切[11]。内源性短链RNA能够通过与靶基因部分或完全互补抑制其翻译或令其降解，从而在转录后水平沉默基因表达的作用。miRNA家族作为基因表达调控网络中的重要组成部分，参与多条信号通路的调控，而对其靶基因的确定及功能分析是理解miRNA作用机制的关键。因此，本实验通过检测miR-153和Survivin在子宫颈癌组织和正常子宫颈组织中的表达水平，探讨其在子宫颈癌中的作用机制，预测其在临床中的作用。

miR-153是新近发现与肿瘤密切相关的miRNA之一，在不同的肿瘤组织中其表达不尽相同。miR-153在导管腺癌、乳腺癌、骨肉瘤中表达明显下调，可抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭；而在结直肠癌中高表达，会间接增强肿瘤细胞的侵袭能力，促进疾病发展[12-14]，目前还未见miR-153在子宫颈癌中的相关分析。本实验发现，miR-153在子宫颈癌组织中的相对表达量明显低于正常子宫颈组织(t=16.333，P<0.01)；进一步分析miR-153与子宫颈癌临床病理特征的关系，miR-153表达与子宫颈癌患者年龄、肿瘤大小、TNM分期无关(P>0.05)，但与淋巴结转移相关(χ2=6.455，P<0.05)；通过相关性分析发现，淋巴结转移患者其受侵数目与miR-153表达之间呈负相关(P<0.01)；通过miR-153表达水平与患者的生存情况分析，miR-153高表达患者生存率、中位生存期(73.33%、24个月)明显高于低表达患者(45.71%、17个月)，差异有统计学意义(χ2=19.390，P=0.01)。以上结果说明miR-153表达水平下调可能促进子宫颈癌细胞增殖，并对子宫颈癌的发生、发展及转移起关键作用。

Survivin是目前筛选分离的分子量最小，但凋亡抑制活性最强的抑制因子，通过对半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-7活性的抑制发挥抗凋亡作用，通过对细胞周期的调控促进肿瘤细胞的增殖。有关文献报道Survivin在胃癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤中均高表达[15-16]。本实验发现，Survivin在子宫颈癌组织中的相对表达量明显高于正常子宫颈组织(t=6.407，P均<0.01)；通过散点图及相关性分析，发现在子宫颈癌组织中miR-153和Survivin表达量呈负相关(P<0.01)；进一步分析Survivin与子宫颈癌临床病理特征的关系，Survivin表达与子宫颈癌患者年龄、肿瘤大小、TNM分期无关(P>0.05)，与淋巴结转移相关(χ2=5.937，P<0.05)；通过相关性分析发现，淋巴结转移患者其受侵数目和Survivin表达量之间呈正相关(P<0.01)；通过分析Survivin表达水平与患者生存曲线发现，Survivin高表达患者生存率、中位生存期(45.95%、16个月)明显低于低表达患者(76.92%、25个月)，差异有统计学意义(χ2=27.921，P<0.01)。以上结果说明在子宫颈癌组织中Survivin相对高表达会抑制子宫颈癌细胞凋亡、改变细胞周期，使癌细胞增殖过度，导致子宫颈癌的发生、发展。

综上所述，miR-153在子宫颈癌组织中表达下调，且与Survivin表达呈负相关，可能调控Survivin表达，促进肿瘤的发生、发展，但由于本实验样本数较少，关于miR-153的具体调控Survivin机制及信号通路尚需后续深入探讨。