苍艾挥发油对被动吸烟小鼠上呼吸道的保护作用

陈柏君 王进进 陈宗翰

[摘要] 目的 探討苍艾挥发油（CAVO）吸入给药的安全性及其对被动吸烟小鼠上呼吸道保护作用的机制。 方法 共计60只SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，取20只采用随机数字表法分为空白组及药物组（CAVO 2%），每组10只，进行CAVO安全性评价。另40只按照随机数字表法分为被动吸烟模型组（模型组），CAVO高（3%）、中（2%）、低（1%）剂量组，每组10只，进行CAVO上呼吸道保护作用研究。除空白组外，其余各组复制模型组小鼠。在自制烟熏室内点燃3支香烟，早晚各1次，共计20 d。CAVO高、中、低剂量组造模同时吸入给药20 d，早晚各1次，每次持续时间30 min。于造模给药第21天取小鼠唾液采用酶联免疫吸附试验测定小鼠唾液分泌型免疫球蛋白（SIgA）含量。摘眼球取血测小鼠的白细胞计数、中性粒细胞百分比。并取出咽后壁组织进行观察。 结果 药物组小鼠白细胞计数和中性粒细胞百分比、SIgA含量、眼部组织与空白组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与空白组比较，模型组小鼠SIgA含量明显降低，白细胞计数、中性粒细胞百分比明显升高（P < 0.01），咽部组织病理切片病变程度积分升高（P < 0.01）。与模型组比较，CAVO高、中、低剂量组，SIgA含量升高，白细胞计数和中性粒细胞百分比降低（P < 0.01）;CAVO中、高剂量组咽部组织病理切片病变程度积分降低（P < 0.01）。 结论 CAVO吸入给药可降低被动吸烟对上呼吸道的损伤，修复上呼吸道的黏膜屏障，保护小鼠的上呼吸道黏膜免疫功能，并对小鼠上呼吸道无刺激。

[关键词] 苍艾挥发油;被动吸烟;分泌型免疫球蛋白A;黏膜免疫;上呼吸道损伤

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）03（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the safety of Cangai Volatile Oil （CAVO） by inhaled administration and the protective effect. Methods A total of 60 SPF Kunming mice with half male and half female were selected， and 20 of them were randomly divided into blank group and drug group （CAVO 2%） by random number table method， with 10 mice in each group for study the safety evaluation of CAVO. The other 40 were divided into the passive smoking model group （mode group）， the CAVO high （3%）， medium （2%） and low （1%） dose groups according to the random number table method， with 10 mice in each group for the study of protective effect of CAVO on upper respiratory tract. The model group were replicated in all groups except the blank group. Light 3 cigarettes in the homemade smoke room， once in the morning and once in the evening， for 20 days in total. The high， medium and low dose CAVO groups were molded and inhaled for 20 days at the same time， once in the morning and once in the evening， each lasting for 30 min. Secretory immunoglo-bulin A （SIgA） content in saliva of mice was determined by enzyme-linked immunosorbent assay on the 21st day of model administration. White blood cell count and percentage of neutrophils in mice were measured by eyeball extraction. The tissue of posterior pharyngeal wall was taken out for observation. Results There was no statistically significant difference in the white blood cell count and percentage of neutrophils， content of SIgA and ocular tissues between the drug group and the blank group （P > 0.05）. Compared with the blank group， the content of SIgA in the model group was significantly decreased， and the white blood cell count and the percentage of neutrophils were significantly increased （P < 0.01）， and the score of lesion degree in the pathological sections of pharyngeal tissues was increased （P < 0.01）. Compared with the model group， the content of SIgA increased and the white blood cell count and percentage of neutrophils decreased in the CAVO high， medium and low dose groups （P < 0.01）. The score of lesion degree in pharyngeal histopathological sections decreased in CAVO medium and high dose groups （P < 0.01）. Conclusion CAVO inhalation administration can reduce the damage of the upper respiratory tract caused by passive smoking， repair the mucosal barrier of the upper respiratory tract， protect the mucosal immune function of the upper respiratory tract of mice， and has no stimulation to the upper respiratory tract of mice.

[Key words] Cangai Volatile Oil; Smoking model mice; Secretory immunoglobulin A; Mucosal immune

据世界卫生组织（WHO）调查研究显示，目前世界上有13亿烟民，我国吸烟人数就有3.5亿之多，二手烟雾每年造成60万例过早死亡[1]。吸烟及被动吸烟对人体的健康危害已引起人们普遍关注，尤其是对婴幼儿健康的危害，他们的活动场所为主要家庭，吸入二手烟的机会较多更易形成被动吸烟。研究提示被動吸烟能降低上呼吸道的黏膜免疫功能，增加呼吸系统疾病的发病率[2]，影响儿童的健康成长，因此不能忽视。苍艾挥发油（Cang ai volatile oil，CAVO）是熊磊教授防治上呼吸道感染的临床效验方，本研究拟通过观察CAVO对被动吸烟小鼠上呼吸道黏膜的影响，探讨CAVO对被动吸烟小鼠上呼吸道的保护作用机制，为相关研究提供新视角。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

60只清洁级（SPF）昆明种小鼠雌雄各半，体重（20±2）g，购自四川省医学科学院实验动物研究所，动物生产许可证号：SCXK（川）2008-16，SPF级使用环境由云南中医药大学动物实验中心提供，动物使用许可证号：SYXK（滇）K2008-0005，经云南中医药大学伦理委员会批准，饲养于学校动物实验中心非屏障室，室温18～22℃，自由饮食，光照明暗控制12 h/12 h，湿度50%～60%，实验前分笼饲养24 h。

1.2 药物与试剂

制备CAVO所需药物购自云南中医学院门诊部，按照《中华人民共和国药典》[3]2015版挥发油测定法2204甲法进行提取，用无水硫酸钠去除其中水分得金黄色油状液体，气味芳香，密度<1 mg/mL，1 mL≈0.8 g，置于棕色瓶中，放入4℃的冰箱备用。实验时用0.5%的吐温-80溶液配制使用。小鼠唾液分泌型免疫球蛋白IgA（SIgA）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（德国Reci公司，批号：lr-00130 15）;硝酸毛果芸香碱滴眼液（山东博士伦富润达制药有限公司，批号：9080503）。香烟购自红塔烟草有限责任公司，烟气烟碱量：1.2 mg，焦油量：13 mg，烟气一氧化碳量：13 mg。

1.3 仪器与设备

自制烟熏室（自制密封玻璃箱70 cm×40 cm×40 cm，五面体，其下部有4个直径1 cm的半圆形透气小孔）;酶标仪（上海生化有限公司，MK3）;隔水培养箱（北京永光明设备有限公司，DHP-9052）;电香薰炉（广州市鑫圆电子科技有限公司）;血常规分析仪（北京立邦有限公司，FC-717）。

1.4 方法

1.4.1 CAVO对正常小鼠上呼吸道的安全性评价  分组及给药：取20只SPF级昆明种小鼠雌雄各半，按照随机数字表法分为两组，空白组及药物组（CAVO 2%），每组10只。用自制烟熏室将小鼠连同饲养笼、电香薰炉一起密闭在内，吸入给药20 d。

1.4.2 CAVO对被动吸烟小鼠上呼吸道的保护作用研究  分组给药与模型复制[4]：取40只SPF级昆明种小鼠雌雄各半，按照随机数字表法分为4组，每组10只：被动吸烟模型组（模型组），CAVO高（3%）、中（2%）、低（1%）剂量组。“1.4.1”中空白组仍作为空白组。除空白组外，其余各组复制被动吸烟模型小鼠。在自制烟熏室内点燃3支香烟，早晚各1次，共计20 d。药物治疗组造模同时给予CAVO高、中、低剂量吸入给药20 d，早晚各1次，每次持续时间30 min，于造模给药第21天取小鼠唾液，摘眼球取血并取出咽后壁组织，常温下用10%甲醛固定备用。

1.4.3 指标检测  SIgA含量：腹腔注射毛果芸香碱滴眼液0.2 mL，3 min后开始收集唾液，在离心小管内，放入-18℃的冰箱中保存备用。固相夹心法ELISA测定小鼠唾液SIgA含量。

眼底静脉血常规：将血液收集在放有肝素的离心小管内，用血常规检测仪测小鼠的白细胞计数、中性粒细胞百分比。

咽后壁组织切片：处死小鼠后，取咽部组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红（HE）染色后在光学显微镜下观察[5]上皮增生、上皮脱落、血管扩张充血、炎细胞浸润、腺体分泌、腺体增生、腺体扩张、纤维增生情况，按程度积分。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验;不符合正态分布改用中位数（M）和四分位数（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验;以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAVO对正常小鼠上呼吸道的安全性

2.1.1 免疫指标  药物组小鼠白细胞计数和中性粒细胞百分比、SIgA含量与空白组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.1.2 咽部组织切片  光镜下观察空白组无黏膜上皮增生或脱落，也未见血管扩张充血及纤维组织增生;咽部各层均无炎性细胞浸润，无腺体分泌异常、腺体增生及扩张现象。药物组小鼠咽部组织黏膜上皮完整，无坏死脱落及增生现象，黏膜固有层及黏膜下层无血管扩张充血、炎性细胞浸润及纤维组织增生现象，黏膜下层黏液腺之形态及分泌无异常。与空白组比较，药物组的咽部组织无影响，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2、图1。

2.2 CAVO对被动吸烟小鼠上呼吸道的保护作用

2.2.1 免疫指标  与空白组比较，模型组小鼠SIgA含量明显降低，白细胞计数、中性粒细胞百分比明显上升（P < 0.01）;与模型组比较，CAVO高、中、低剂量组，SIgA含量升高，白细胞计数和中性粒细胞百分比降低（P < 0.01）。见表3。

2.2.2 咽部组织病理切片  与空白比较，模型组小鼠病变程度积分升高（P < 0.01）;与模型组比较，CAVO中、高剂量组病变程度积分降低（P < 0.01）。见表4。模型组血管明显扩张充血，轻度腺体及腺上皮增生，大量炎细胞浸润（图4B～D）;CAVO低剂量腺体明显扩张，血管轻度扩张、充血、炎细胞侵润（图4E～F）;CAVO中剂量组腺体轻度扩张，散在炎细胞侵（图4G）;CAVO高剂量组腺体扩张不明显，散在炎细胞侵润（图4H）。见图2。

3 讨论

上呼吸道的黏膜免疫是人体防御疾病的重要防线，SIgA是执行局部黏膜免疫的主要抗体。被动吸烟能降低儿童上呼吸道的免疫功能[6-8]，增加呼吸道疾病的患病风险。儿童接触环境中被动吸烟的强度与呼吸道感染率相关，特别是儿童与父母在同一房间的被动吸烟[9]。研究显示，香烟烟雾在体外[10]和体内[11]都显著降低了呼吸道上皮细胞的纤毛摆动，可损害小鼠鼻腔上皮细胞的纤毛生长[12]。香烟的烟雾也与黏液分泌密切相关，慢性接触烟雾可导致呼吸道上皮化生的杯状细胞的数量和大小增加，从而增加上呼吸道的黏液分泌[13]。烟雾还抑制鼻腔中上皮细胞白细胞介素（IL）-8和人β防御素-2（human β-defensin-2，HBD-2）的含量，提示香烟烟雾可能对鼻腔固有免疫具有抑制作用[14]。此外，烟草烟雾增加了呼吸道黏膜对各种病毒和细菌[15]的易感性，这可能导致反复的呼吸道感染。

本研究结果与文献报道一致，被动吸烟后模型小鼠的上呼吸道黏膜免疫的屏障功能遭到破坏，咽后壁組织的黏膜上皮有轻至中度增生，固有层及黏膜下血管显著扩张充血，炎细胞呈轻至重度浸润，以淋巴、单核细胞为主，黏膜固有层有轻、中度纤维组织增生现象，黏膜下层内黏液腺呈中、重度扩张，腺体分泌活跃，腺腔内分泌物增多，腺上皮也有不同程度增生，腺腔狭窄，呈现出慢性组织病理改变;同时由于黏膜的屏障功能遭到破坏，导致局部SIgA合成障碍，向黏膜表面的转运也受影响，因此检测发现小鼠唾液SIgA含量明显降低。

中医有“芳香避秽”“闻气治病”之说，“药气从口、鼻孔中直达肺，通经贯络，透彻周身，卒病治疴，从症用之，以助服药之所不及”等记载。口鼻相通，鼻下连及气管和肺，药物吸入后可直达上呼吸道而发挥治疗作用的[16]。前期研究显示，CAVO大鼠经鼻吸入给药后，肺组织中含量最高[17]，对于防治呼吸道疾病有一定的优势。

CAVO系熊磊教授防治上呼吸道感染的临床效验方，选用苍术、艾叶、藿香等含挥发油成分较多、气味清香、抗菌力强的中药为组方。方中苍术、艾叶芳香化湿、避秽解毒为君;藿香芳香化湿、解表祛暑为臣，诸药合用，共奏芳香化浊、避秽解毒之功。前期研究提示CAVO对金黄色葡萄球菌，甲型、乙型链球菌，肺炎链球菌等上呼吸道感染的常见菌株有明显的抑菌作用[18]。经GC-MS检测CAVO中的主要成分为1，8-桉叶素、广藿香醇、β-石竹烯等，现代研究显示，1，8-桉叶素[19]、广藿香醇[20]、β-石竹烯[21]等具有较好的抗菌、抗炎、免疫调节作用。被动吸烟能造成小鼠上呼吸道黏膜慢性炎症损伤，同时能降低SIgA的含量，这与以往文献报道相符，CAVO吸入给药对正常小鼠上呼吸道黏膜无刺激，可修复被动吸烟模型小鼠上呼吸道黏膜损伤，提高唾液SIgA的含量，由此推测，CAVO对被动吸烟小鼠上呼吸道的保护作用与修复上呼吸道黏膜的屏障功能，同时促进SIgA的合成分泌相关。

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（收稿日期：2019-07-11  本文编辑：刘永巧）