翼状胬肉形成相关基因的表达研究

赵 牧，王 宇，2

（1.攀枝花学院 医学院，四川 攀枝花617000；2.攀枝花学院附属医院，四川 攀枝花617000）

翼状胬肉是一种常见的眼表疾病，局部球结膜纤维血管组织呈三角形膜样增生侵犯角膜而引发形成，其酷似昆虫翅膀而得名。紫外线、风沙、过敏等因素是引发该病的主要外部因素，发病机理涉及解剖学、病理学、分子生物学、免疫学及病毒学等多个领域，但现在仍然存在争议［1-2］。目前，翼状胬肉的治疗仍以手术为主，但术后复发率较高，具有某些肿瘤样特性，所以现在很多学者将其作为一种良性肿瘤样病变进行研究，取得了一些研究成果［3］。

本研究通过前期构建的翼状胬肉cDNA文库，找到一些在翼状胬肉组织中表达的基因，通过采用实时荧光定量逆转录PCR技术比较这些基因在翼状胬肉与正常结膜组织中的表达差异，从分子水平上探讨翼状胬肉形成的病因，为其进一步的预防和治疗奠定基础。

1 资料和方法

1.1 一般资料

32例翼状胬肉组织标本随机取自攀枝花学院附属医院的眼科手术病人，其中男18例，女14例，年龄为38-72岁，平均年龄49.2岁，所有患者均无其他结膜疾患。同时将患者眼角膜上缘上方的切缘中的正常球结膜组织作为对照，手术取样后迅速置于液氮中，-80℃保存。

1.2 主要仪器和试剂

总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，RNase-free DNase I购于Fermentas公司，荧光定量PCR试剂盒、凝胶成像系统和PCR仪购于美国伯乐公司，微量紫外分光光度计购于美国贝克曼公司。PCR引物由苏州金唯智公司合成。

1.3 引物设计

使用Primer5.0软件设计特异性定量PCR引物，在NCBI数据库中进行引物特异性比对，引物具体信息见表1。

表1 PCR引物序列

1.4 RNA提取和反转录

按照微量样品总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）的使用说明操作提取翼状胬肉组织的总RNA，然后用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的完整性和纯度。为了消除基因组DNA的污染，用RNase-free DNase I对总RNA进行处理，最后按照反转录试剂盒的说明进行反转录得到cDNA。

1.5 荧光定量逆转录PCR反应

以人18SrRNA为内参基因，用qRT-PCR对基因表达进行检测，反应体系为25μL：1μL cDNA，12.5μL SYBR Green mixture，上下游引物（10μM）各0.5μL，10.5μL水。反应体系为：95℃预变性10 min；然后95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s进行42个循环，添加熔解曲线，确保扩增产物的特异性，每个样品重复测定3次。采用2-ΔΔCt法对qRT-PCR得到的试验数据进行分析。

1.6 统计学分析

各项数据以均数和标准差（x±s）表示，两组样本间采用t检验分析。

2 结果

2.1 总RNA的鉴定

从翼状胬肉及正常球结膜组织中抽提总RNA，经凝胶电泳检测，RNA无明显降解；紫外分光光度计检测，之间，表明RNA纯度较高，可用于后续实验。

2.2 基因的表达检测

通过检测干扰素诱导蛋白（IFI27）、三叶肽因子3（TFF3）、桥粒斑蛋白（Pkp2）、Rho GTPase激活蛋白（RhoGAP）、活性氧调节因子（ROMO1）和环氧化酶2（COX-2）的表达水平，发现这些基因在翼状胬肉组织中的表达明显高于正常球结膜组织（P＜0.01）（图1）。

3 讨论

翼状胬肉的发病机制非常复杂，环境因素的刺激与翼状胬肉的发生密切相关，尤其是海员、渔民、沙石工人长期受到强烈光线照射、风沙、烟尘等因素的影响，使角膜缘部结膜血管或结膜组织发生非感染性慢性炎症，最终造成弹性纤维与胶原纤维的增生和变性，这是翼状胬肉较为突出的病理改变，同时大量的基因突变也会启动正常结膜及纤维血管组织过度增殖而引起翼状胬肉［4］。现在研究表明长期接触生产性毒物如氟、砷、二氧化硫和粉尘，也会导致翼状胬肉［5］。

图1 差异表达基因的qRT-PCR分析

本研究通过对上述基因的研究，可以发现翼状胬肉也是一种与血管生成、纤维生成和炎性因子相关的疾病。干扰素诱导蛋白（IFI27）是干扰素诱导蛋白200家族的成员之一，参与了多种细胞活动，包括炎症反应、免疫反应、细胞增殖，细胞凋亡等，已有研究表明干扰素诱导蛋白主要介导Thl型炎症反应，其家族成员的异常表达与多种肿瘤的发生密切相关［6-7］。桥粒斑蛋白（Pkp2）是桥粒的主要蛋白成分之一，起连接细胞内中间丝和桥粒的作用，它不仅与离子转运相关通道有关，而且通过免疫组化实验发现其在鳞癌、腺癌等多种癌细胞内进行表达，已成为肿瘤检测的标记物［8］。三叶肽因子3（TFF3）是一类富含半膀氨酸的小分子肽，在外周血中能够稳定测定，是一种重要的信息分子。它与黏液糖蛋白相互作用，可诱导上皮细胞迁移，促使损伤后黏膜快速修复；TFF3可能通过酪氨酸或双重特别性磷酸酶活性的激活调节细胞内信息通道，能抑制有丝分裂原激活的蛋白激酶和信息相关蛋白激酶的活性，从而参与信号传导，TFF3也可能为角膜内的浸润提供传导信号［9-10］。Rho GTPase激活蛋白（RhoGAP）是Ras超家族的成员之一，具有GTPase酶活性。它是一种多信号调控分子，可以调节多种细胞功能并且能和其他蛋白相互作用，参与细胞的多项生命活动，如肌动蛋白细胞骨架的重构、细胞黏附和运动、囊泡运输、基因表达和细胞周期的调控等［11-12］。由于Rho GTPase在细胞信号转导中有着重要的作用，对于揭示信号转导机制和临床上多种疾病的发病机制具有重要的指导意义。活性氧调节因子（ROMO1）是一种新型的线粒体跨膜蛋白，可以控制细胞内活性氧（ROS）的水平，对细胞的增殖产生决定性作用，因此可以通过诱导线粒体产生ROS发挥致癌作用［13］。ROS不仅可以引起DNA的氧化损伤，还能通过化学机制产生环氧化酶2（COX-2）。COX-2由604个氨基酸组成，是一种“应答基因”，正常状态下在多数组织中不表达，在各种诱导因子的刺激下进行表达，调节细胞的增殖与分化，它也是促进翼状胬肉形成的一种重要诱导酶［14］。

本研究通过发现一些可能参与翼状胬肉形成的基因，为从分子学角度深入研究翼状胬肉的发病机制提供了帮助。下一步可以进行深入研究，能否将上述基因作为翼状胬肉早期诊断的分子标志物，同时可以作为治疗的分子靶标，利用RNA干扰技术阻碍其表达，达到治疗的目的。