AKR1B10基因沉默对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

钱瑞坤， 马长林， 乔 森

济宁市第一人民医院 肝胆外科， 山东 济宁 272100

肝细胞癌(HCC)是肝脏中最常见的恶性原发性肿瘤，也是全球癌症死亡的第二大主要原因。已发现醛酮还原酶家族1成员B10(aldo-keto reductase family 1 member B10，AKR1B10)在HCC、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌中高表达[1-4]。

AKR1B10是醛酮还原酶(aldo-keto reductase，AKR)超家族的一员，AKR是一种以NADPH为辅酶的氧化还原酶基因超家族，可催化醛酮类物质转化为相应的醇。AKR在不同的生物体内可参与多种生物学过程，包括羰基解毒、渗透调节、激素代谢、脂质合成、肿瘤的发生与治疗[5]。AKR1B10在人类肝癌中高表达，但其调控机制仍不明确。为了解AKR1B10在肝癌中的致癌作用，本研究使用shRNA敲减方法进一步分析了AKR1B10沉默对肝癌生物表型的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 HepG2及Huh7 HCC细胞株均在含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 g/ml)的DMEM培养基中培养，放置于37℃、含有5%CO2的恒温培养箱中。

1.2 AKR1B10敲减 将1×105Huh7及HepG2 HCC细胞接种在装有2 ml新鲜完全培养基的6孔板中。过夜孵育后，除去培养基，加入2 ml含shRNA-AKR1B10慢病毒颗粒的培养基(含10 μg/ml polybrene)。24 h后，除去含有病毒的培养基，每孔加入2 ml新鲜完全培养基(DMEM+10%胎牛血清)。48 h后，用含有1 μg/ml嘌呤霉素的培养基筛选阳性细胞。

1.3 AnnexinV-APC/PI双染法检测细胞凋亡 稳转shRNA-scramble的HepG2及 Huh7细胞(对照组)及敲减AKR1B10的HepG2及 Huh7细胞(敲减组)消化后，收集5×105个细胞，AnnexinV-APC和PI(Abnova)染料双染，利用流式细胞仪(BD Biosciences)进行检测，具体的实验步骤参考试剂盒说明书。

1.4 克隆形成实验 取对数生长期的细胞，用胰酶消化后计数。在6孔板里进行，每孔铺种Huh7细胞2000个，每孔2 ml培养液 (DMEM+10% FBS) 于培养箱中进行培养，每3天更换1次培养液，培养10 d左右，弃培养液，用预冷的PBS洗涤2次之后，甲醇固定15 min，再用结晶紫染色10 min。……