miR-370通过FoxM1相关通路调控人视网膜母细胞瘤细胞凋亡机制研究△

许思思 朱冬梅 李晓华

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)是一类恶性眼底病变，主要发病人群为0～4岁儿童，RB对患儿的视功能甚至生命都存在着巨大威胁。目前，我国对该病的早期临床筛查手段尚不完善，导致该病多被发现于晚期，致使患儿死亡率较高[1-2]。微小RNA(miRNA)是由内源性基因编码的单链非编码RNA，在机体的不同组织细胞内发挥重要的调控作用[3]。miR-370是一类于人体胚胎干细胞中被克隆的miRNA，对多种恶性肿瘤的发展均有调节作用[4]。但其在RB中的研究尚鲜见报道。

本研究通过Lipofectamine TM 2000将miR-370-mimics、miR-370-NC及miR-370-inhibitor转染至RB细胞Y79内，分别建立miR-370过表达组(mimics组)、对照组(NC组)和抑制组(inhibitor组)，探讨miR-370的表达对RB细胞Y79增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制，为RB的临床治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞株与实验试剂RB细胞株Y79购自中国科学院上海细胞库；含双抗的RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；miR-370-mimics、miR-370-NC及miR-370-inhibitor由上海吉玛制药技术有限公司合成；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自德国美天旎公司；Lipofectamine TM 2000，鼠抗人PI3K、P-AKT、FoxM1、β-actin单克隆抗体，Trizol均购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自杭州四季青公司。

1.2 细胞复苏与转染将冷冻保存的RB细胞株Y79解冻、复苏，重悬于含体积分数10%的胎牛血清RPMI1640培养液中，于37 ℃、含体积分数5%的CO2细胞培养箱中培养，每2～3 d传代一次，取对数生长期细胞进行转染。转染时，将Y79细胞转移至6孔板，调整细胞密度为每孔5×105个，用不含双抗和胎牛血清的培养液培养24 h，然后根据Lipofectamine TM 2000试剂盒说明书所示步骤，将miR-370-mimics、miR-370-NC及miR-370-inhibitor分别转染至Y79细胞内，根据转染物不同，将细胞分为过表达组(mimics组)、对照组(NC组)及抑制组(inhibitor组)，转染6 h后，将各组细胞转移至完全培养基继续培养，以供后续实验使用。

1.3 RT-PCR检测细胞内miR-370表达细胞转染48 h后，收集各组细胞，Trizol提取总RNA，异丙醇处理后收集RNA沉淀，体积分数75%乙醇洗涤，离心后弃上清液，DEPC水溶解RNA。根据逆转录试剂盒说明，以β-actin为内参进行PCR扩增，反应条件：95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃总延伸6 min。取5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，进行灰度扫描分析，比较目的基因与β-actin条带灰度的比值。miR-370上游引物序列为5’-TAGCGGGTTTTGCTAGGGC -3’，下游序列为5’-TAGCGCCTAGGGCATCGATC-3’；β-actin引物序列为5’-TAGGGCTTAGCCATGCCAT -3’，下游序列为5’-TAGGCTAGCCCATACGTACA-3’。独立重复3次实验，取其平均值。

1.4 CCK-8检测细胞增殖将转染后细胞转移至96孔板，调整细胞浓度为每孔2×103个，每组设6个复孔，在转染24 h、48 h、72 h和96 h时，均向每组细胞培养孔内加入CCK-8试剂溶液10 μL检测细胞增殖,培养箱中继续孵育2 h，用紫外分光光度计检测490 nm波长处的吸光度(A)值，并以此代表细胞增殖活性。

1.5 Annexin V-FITC/PI联合流式细胞仪检测细胞凋亡细胞转染48 h后，预冷PBS洗涤2次，将细胞重悬于10×Binding Buffer中，根据凋亡试剂盒说明步骤，向含细胞的缓冲液中加入AnnexinV-FITC，避光反应15 min,在上流式细胞仪之前加入PI，5 min之内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。独立重复3次实验，取其平均值。

1.6 Western Blot检测细胞PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达细胞转染48 h后，收集各组细胞，RIPA裂解液提取总蛋白，将蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶加样孔进行电泳，将蛋白转移至PVDF膜，于体积分数5%的脱脂奶中室温封闭2 h，TBST温和洗膜3 min后加入相对应的一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤10 min×3次，加入二抗，室温下孵育1 h；TBST洗涤10 min×3次，加入配制好的ECL发光液，避光孵育5 min。化学发光凝胶成像仪中采集图片信息，图片用Image pro plus 6.0软件进行灰度分析。独立重复3次实验。

1.7 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析；计量资料以均数±标准差表示，多组计量资料间的比较使用ANOVA检验，组内两两比较采用LSD-t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组细胞内miR-370表达结果转染48 h后， RT-PCR检测结果显示， mimics组细胞内miR-370 mRNA相对表达量为1.41±0.08，较其他两组均显著增加(均为P<0.05)。NC组细胞内miR-370 mRNA相对表达量为0.34±0.03，inhibitor组细胞内miR-370 mRNA相对表达量为0.09±0.01，较其他两组均显著减弱(均为P<0.05)。

2.2 各组细胞增殖活性检测结果CCK-8检测结果显示，自转染48 h起，inhibitor组细胞增殖活性均显著高于其他两组(均为P<0.05)，而mimics组细胞增殖活性均显著低于其他两组(均为P<0.05)，这种趋势一直持续至转染后96 h。见图1。

图1 CCK-8检测各组细胞增殖活性 与mimics组相比，aPbPcP

2.3 各组细胞早期凋亡率检测结果Annexin V-FITC/PI联合流式细胞仪检测结果显示，转染48 h后， mimics组细胞早期凋亡率均显著高于其他两组(均为P<0.05)，而inhibitor组细胞早期凋亡率在三组中最低(P<0.05)。见图2。

图2 Annexin V-FITC/PI联合流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡率 与mimics组相比，aPbPcP

2.4 各组细胞PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达结果Western Blot检测结果显示，转染48 h后，mimics组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达均显著低于其他两组(均为P<0.05)，而inhibitor组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达在三组中最高，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。见图3。

图3 Western Blot检测各组细胞PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达 与mimics组相比，aPbPcP

3 讨论

miR-370作为微小RNA家族的成员之一，近年的研究表明，其对多种肿瘤细胞的生物学行为均有调控作用。Shen等[5]研究发现，miR-370通过靶向MDM4促进结肠癌细胞的凋亡；韩玲[6]研究发现，miR-370能调控非小细胞肺癌细胞的转移和侵袭；Chen等[7]报道，下调食管鳞状细胞癌细胞中miR-370的表达，能促进该癌细胞的增殖。但目前miR-370在RB中的作用尚鲜有报道，基于以上研究支持，本研究中，我们探讨miR-370对RB细胞Y79增殖和凋亡的影响，结果显示， miR-370作为抑癌基因能够在RB细胞中发挥一定作用。

为进一步探讨miR-370在RB细胞中的作用机制，我们进一步检测了miR-370的潜在靶向因子。PI3K/AKT信号通路是一类重要的细胞内生物信号转导通路，其异常活化能使多种下游底物被激活，导致正常细胞向恶性细胞转化，促进细胞的增殖、转移、侵袭能力，并抑制细胞凋亡[8]，且该通路在RB细胞的生物学活动中发挥重要的调节作用[9]。FoxM1为叉头框(forkhead box, Fox)转录因子家族成员之一，具有刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡、调控细胞周期、促进细胞EMT过程等多种作用[10]，其在多种始体瘤细胞中有高表达[11-12]。PI3K/AKT通路的活化能促使FoxM1在肿瘤细胞中高表达，FoxM1与PI3K/AKT信号通路存在相互作用，共同调控肿瘤细胞的增殖、凋亡等生物学活动[13]。彭泽生等[14]研究发现，miR-370-3p能够靶向调控FoxM1抑制U87-MG细胞的增殖能力；Feng等[15]报道，miR-370能负向调控FoxM1在幽门螺杆菌诱导的胃癌中的过度表达。基于以上理论，我们在本次研究中检测了miR-370不同表达水平下的Y79细胞中PI3K/p-AKT/ FoxM1表达水平，结果显示，mimics组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达在三组中呈最低水平，而inhibitor组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达在三组中最高，说明PI3K/p-AKT/ FoxM1通路可能是miR-370的靶向因子，miR-370对Y79细胞的增殖、凋亡影响可能是通过对该通路的调控实现的。

综上所述，miR-370作为抑癌基因，能抑制RB细胞Y79的增殖，促进其凋亡，这种影响可能是通过负性调节PI3K/AKT/FoxM1信号通路而实现的。