不同稻田栽培模式下土壤细菌群落多样性分析

宋 宇,王 鹏,韦月平

(辽东学院, 辽宁 丹东 118003)

【研究意义】土壤微生物数量巨大，种类繁多，细菌是土壤中数量最为丰富、分布最为广泛的微生物类群[1]。土壤细菌在有机物质分解、养分运转、土壤结构维持和温室气体产生等方面发挥着重要的调节作用[2-3]。同时，土壤细菌的数量和结构受土壤类型、土壤理化性质、植被类型和农田管理制度等多方面因素的影响[4-6]。由于世界人口的增长，粮食安全正成为一个全球性的问题。大米是大约30亿人日常饮食中的主要成分。因此水稻生产是全球粮食安全的重要组成部分。过去几十年中，由于大量使用化肥和农药，水稻产量有所增加，但化肥和农药的过量使用会导致土壤酸化板结、温室气体排放增加、水体富氧化等一系列生态环境问题[7-9]。如今，以当地和可再生资源为基础，将个别农场的作物和动物生产有效结合起来以提高养分循环效率为目的的生态循环农业则受到人们广泛关注。相关研究描述了水稻-鱼、稻-鸭、稻-龟和稻蛙种植生态系统并说明了这些做法如何降低化肥和农药施用量[10]，但对水稻种植模式的研究大多集中在病虫害、土壤理化性质的影响上[11-13]，而对不同栽培模式下稻田土壤细菌多样性的研究则鲜见。【前人研究进展】传统的土壤微生物分离培养方法难以反映土壤微生物群落的结构、丰度及其作用机制[14],20世纪末，随着PCR、DGGE、T-RFLP等分子生物技术的发展为研究环境样品中微生物的群落多样性和丰度成为可能，但检测到的细菌群落丰度相对较低，范围较小且操作复杂成本高[15]。高通量测序技术具有灵敏度高的优点且低错误率、低成本可较快速准确地获取土壤微生物信息[16]因而被应用于细菌群落多样性分析中。【本研究切入点】本研究使用高通量测序技术开展3种不同栽培模式下稻田表层土壤细菌多样性研究。【拟解决的关键问题】探讨不同栽培模式稻田表层土壤细菌多样性，不同分类水平的优势类群及各类群的相对丰度，细菌多样性和土壤理化性质的关系。为生态循环农业提升稻田土壤质量合理选择水稻栽培模式提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与试验设计

试验于2018年9月28日水稻结穗期在丹东东港市北井子镇盖家坝农场进行,供试稻田分别是河蟹共作稻田(SDHXZ)、非洲雁共作稻田(SDFYZ)和单作稻田(SDKBZ)，分别在3个模式稻田进行5点取样，采集0～5 cm的表层土壤充分混匀，每份土样分成2份，1份去用于细菌多样性分析，1份用于测土壤理化性质。

1.2 测定方法

1.2.1 土壤理化性质的测定 土壤pH值采用酸度计测定，氨氮和硝氮测定采用氯化钾浸提-分光光度法，速效钾测定采用氯化钙浸提-火焰光度计法,速效磷测定采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，有机质测定采用重铬酸钾氧化-分光光度法。

1.2.2 土壤细菌总DNA提取及高通量测序 样品土壤细菌总DNA提取及高通量测序均在上海美吉生物医药科技有限公司进行。细菌多样性鉴定区域：16SV3～V4区。通用引物为338F(5’-ACTCCTACGGGAGGGAGCA-3’)和806R(5’-GGACTCHVGGGTWTCTAAT-3’)。

1.3 数据处理与生物信息统计方法

使用Trimmomatic和Flash软件进行原始双端序列去杂和拼接。采用Usearch软件进行OTU分析并采用RDP classifier 贝叶斯算法对97 %相似水平的OTU代表序列进行分类学分析。利用mothur软件计算Chao1指数、Ace指数、shannon指数等。利用Qiime计算beta多样性距离矩阵并利用R语言作图。通过statistic10.0软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同栽培模式稻田土壤的理化性质

由表1可以看出,3种栽培模式下稻田土壤的理化性质差异较大，与水稻单作组比，河蟹共作稻田pH值下降而非洲雁共作稻田则上升。河蟹稻田和非洲雁稻田的氨氮，硝氮、速效磷和有机质含量都显著提高，河蟹稻田的速效钾值较单作稻田降低但非洲雁稻田则显著提升。

2.2 土壤样品测序

2.2.1 OTU及分类学分析 通过Illumina MiSeq 高通量测序技术测定9个土壤样本细菌的16SrRNA V3～V4变异区序列，共获得240 070个有效序列数，平均测序长度为420～460 bp。通过Usearch软件结合RDP classifier 贝叶斯算法对97 %相似水平的OTU代表序列进行分类学分析后共获得3157个OTU,分属于48个门，115个纲，224个目，391个科，721个属，1343个种。

表1 不同栽培模式的稻田土壤理化性质

注:数据由平均值和标准差组成,不同的字母代表处理间存在显著差异(P<0.05)相同的字母代表处理间不存在显著差异(P>0.05)。

Notes:The data consists of averages and standard deviations, different letters mean that there are significant differences(P<0.05),while the same letters mean no significant differences(P>0.05).

2.2.2 物种Venn图分析 Venn图是利用R语言对相似水平为97 %的OTU进行统计和作图，可用于多个样本中所共有和独有的物种(如OTU)数目，可以比较直观的表现环境样本的物种(如OTU)组成相似性及重叠情况。从图1可以看出，3种栽培模式稻田土壤细菌共有的OTU数为1525个，SDKBZ 和SDHXZ共有的OTU数最多为2183个，SDKBZ和SDFYZ共有的OTU数最少为1610个。不同的OTU代表不同的物种，SDFYZ特有的OTU数最多为357个，说明特有的物种数最多。

2.3 土壤细菌群落多样性分析

2.3.1 α-多样性分析 α多样性是指某个群落或生境内部的种的多样性，常用的度量标准有Chao1、Shannon、Ace、Coverage等。Chao1指数用来估计群落中含OTU数目的指数。Shannon指数可用来反映样品的多样性程度，其值越高说明群落物种的多样性越高。Ace指数用来估算群落物种的丰富度，其值越高表明物种群落丰度越高。Coverage指数可用来反映测序的深度。从表2可以看出，3种栽培模式的测序覆盖度都达到了99 %，说明各样品的取样都能达到一定深度，能反映各样品土壤细菌群落的真实情况。由表2可以看出，SDHXZ的Chao1、Shannon和Ace 3种多样性指数均高于SDKBZ和SDFYZ，说明有机稻田在引入河蟹后土壤细菌的多样性和丰富度均有提升。而SDFYZ的3种多样性指数却低于SDKBZ和SDHXZ说明非洲雁粪肥的稻田土壤，虽然土壤肥力提升显著但其细菌的多样性和丰度并未得到提升。

图1 不同栽培模式稻田土壤细菌Venn图分析

2.3.2 土壤细菌多样性与理化因子的相关性分析 从表3可以看出，Ace指数和pH及氨态氮呈显著负相关。Shannon指数和硝态氮呈正相关。Chao1和Ace指数均和6种理化因子呈负相关。

2.3.3 β多样性分析 β多样性表示的是微生物群落构成的比较, 可评估微生物群落间的差异。从图2可以看出，SDFYZ和SDHXZ之间及二者与SDKBZ之间的距离都较远，表明3种栽培模式稻田土壤细菌群落的OTU组成差异较大，细菌群落结构的差异也较大。

表2 不同栽培模式下稻田土壤细菌多样性指数

表3 稻田土壤理化因子与细菌群落多样性指数相关性分析

图2 3种栽培模式稻田土壤细菌群落主成分(PCoA)分析图

2.4 3种栽培模式稻田土壤细菌群落组成分析

2.4.1 细菌优势菌门分析 从图3可知，3个样本中含量最高的门是变形菌门(Proteobacteria)，平均丰度为35.51 %，其SDKBZ、SDHXZ和SEDFYZ的相对丰度依次为33.41 %±3.50 %、36.73 %±3.48 %、36.37 %±0.52 %；其次为拟杆菌门(Bacteroidetes)平均丰度为13.69 %，相对丰度依次为12.12 %±2.04 %、15.62 %±3.24 %、13.32 %±5.32 %；绿弯菌门(Chloroflexi)，平均丰度为13.66 %，相对丰度依次为12.22 %±2.32 %、13.64 %±2.48 %、15.12 %±2.63 %；放线菌门(Actinobacteria)，平均丰度为9.67 %，相对依次为8.23 %±1.32 %、6.87 %±1.16 %、13.92±7.28 %；酸杆菌门(Acidobacteria),平均丰度为7.90 %，相对丰度依次为10.31 %±1.05 %、6.88 %±2.37 %、6.52 %±1.34 %；蓝藻菌门(Cyanobacteria)平均丰度为5.38 %，相对丰度依次为8.48 %±1.77 %、5.15 %±2.90 %、2.51 %±1.24 %。其余的硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)等相对丰度较低。说明在3种栽培模式下稻田土壤细菌群落的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和蓝藻菌门(Cyanobacteria)。

图3 3种栽培模式稻田表层土壤优势菌门的微生物组成丰度图

2.4.2 细菌优势菌属分析 从图4可知，平均丰度低于0.01 %的物种被合并为图中的others，其在SDKBZ、SDHXZ和SDFYZ中分别占46.28 %、45.03 %和44.33 %。相对丰度>1 %的优势菌属有18个。共有22个属因在分类学数据库分类学谱系的中间等级，没有科学名称，所以用norank作为标记。主要优势菌属为norank-厌氧绳菌属其在SDKBZ、SDHXZ和SDFYZ中的平均丰度依次为4.49 %、4.24 %和7.00 %；norank-蓝细菌属其平均丰度依次为6.31 %、3.24 %和1.38 %；norank-拟杆菌属-VadinHA17其平均丰度依次为1.85 %、4.74 %和2.63 %；norank-酸杆菌属其平均丰度依次为3.23 %、1.93 %和3.85 %；norank-p-Saccharibacteria其平均丰度依次为2.68 %、3.10 %和1.83 %。

3 讨 论

本研究利用Illumina Miseq平台对16srDNA基因的V3～V4变异区进行高通量测序分析，成功获得3种栽培模式水稻表层土壤细菌群落结构多样性的全面菌群信息。共获得有效序列数240070个，3157个OTUs.其中SDKBZ的OTUs数为2443个、SDHXZ为2540个、SDFYZ为2168个。Venn 图表明3种栽培模式共有的细菌 OTU 数为1525个，SDFYZ特有的 OTU 数为357个，高于SDHXZ 56.3 %,SDKBZ 50.98 %。虽然SDFYZ的 OTU 数低于SDHXZ和SDKBZ，但特有的OTU 数却明显高于SDHXZ和SDKBZ说明仅依靠非洲雁粪肥的稻田土壤可获得更多的细菌特有物种。

图4 3种栽培模式下水稻表层土壤优势属的微生物组成丰度图

本研究通过土壤理化因子测定和α-多样性分析表明，由于河蟹的排泄作用，改变了稻田的pH值并增加了氨态氮、硝态氮及速效磷和有机质的含量，改善了稻田土壤细菌的生长条件同时河蟹通过爬行、打洞等活动有效地增强了土壤的透气性，因此增加了河蟹稻田土壤细菌的多样性和丰度。这和赵翔刚等[17-18]的研究结果一致。而SDFYZ通过非洲雁的排泄作用在没有施加任何肥料的情况下虽然显著提升了土壤各种养分含量但土壤细菌的多样性和丰度并未得到提升，可能和非洲雁是站立行走而非爬行同时雁蹼平钝而非锐利因此会增加土壤的紧密性而影响了土壤的透气性有关。通过β多样性分析表明3种稻田栽培模式的土壤细菌群落结构彼此差异都较大。

有研究表明土壤理化因子对土壤细菌群落有显著的影响[19-20]，本文进行了土壤细菌多样性与理化因子的相关性分析，Ace指数和pH和氨态氮呈显著负相关。Shannon指数和硝态氮呈正相关。Chao1和Ace指数均和6种理化因子呈负相关。

通过样品细菌群落组成分析表明3种栽培模式的土壤表层土壤细菌优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和蓝藻菌门(Cyanobacteria)。其中以变形菌门(Proteobacteria)为最大优势菌门，这和以前的一些研究结果一致[21-23]。相对丰度>1 %的优势菌属有18个。

4 结 论

稻田中放入一定量的河蟹既增加了土壤的养分含量又提升了土壤细菌的多样性，因此具有更好的微生物生态基础。稻田中放入非洲雁，可增加土壤肥力但并未提升土壤细菌的多样性，若采取一定措施增加土壤透气性这能否进一步提升土壤细菌的多样性和丰度还有待于进一步探讨。该研究可为合理选择和改进水稻栽培模式提供一定理论支持。