种球包衣剂防治魔芋软腐病试验研究

杨群辉，何 翔，杨佩文，毕云青，张 庆，曾 波，任思宇，施竹凤，杨明英，谢美华

(1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205；2.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201；3.云南省化工研究院，云南 昆明 650228；4.楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000)

【研究意义】魔芋软腐病是由胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora, Ecc)引起的一种发生较普遍、影响较严重的细菌性病害，整个生育期内均易感病，造成损失可达20 %～50 %，严重时到80 %以上，魔芋软腐病的大面积发生，已成为限制魔芋产业发展的重要因素[1-4]。【前人研究进展】魔芋软腐病的防治已有大量的研究报道，在化学防治、生物防治、农业防治等方面均取得了突破性的进展[5-6]。目前，种球包衣剂的使用已成为根茎类病害防治和促进植物生长的一种新技术方法，但其在魔芋上用于病害防治和促进植株生长的研究报道还较少。夏良荣等[7]选用不同分级规格种芋进行包衣播种，并于魔芋出苗时调查出苗率及植株长势，于软腐病发生高峰期调查植株发病率，收获时测定魔芋的产量和经济效益，结果表明使用包衣剂能显著增加植株的出苗率，降低软腐病的发病率，增产增收。李阔等[8]采用4种黏性较好的土样作为载体，并按照试验配比添加一定量的魔芋拌种剂、农林用保水剂、黏合剂、石灰、锯末等辅料，考察包衣技术对魔芋抗摔能力、光滑程度、各项生理指标及植株出苗率出苗时间的影响，结果表明包衣剂对魔芋的正常生长和代谢能力均有促进作用。近年来，实时荧光定量PCR技术广泛用于检测土壤中的植物病原菌，定量测定病原物的结构和数量，探索土壤微生物群落结构的动态变化，为病害的防治提供了理论和数据支撑。程承等[9]选用烟草青枯菌特异性引物，并通过RT-qPCR技术对土壤中的青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)进行定量检测，结果发现RT-qPCR检测技术的灵敏度要显著优于常规PCR检测技术。周大祥等[10]利用叠氮溴乙锭与RT-qPCR结合，建立了猕猴桃溃疡病菌快速检测的技术体系，在一定程度上有效避免了PCR检测技术造成假阳性的结果。【本研究切入点】魔芋软腐病的初侵染源为染病种芋和带菌土壤，发病时常从地下块茎开始，由于土壤环境的复杂性及不可预见性，使得化学和生物药剂的防病功能迅速减弱。种芋处理是魔芋生产中软腐病防治最重要的环节，并逐渐成为软腐病防治研究的必要措施与研究热点。【拟解决的关键问题】为此，本研究选用一种魔芋专用种球包衣剂，并设置6个不同试验处理，在魔芋播前对其种球进行预处理，魔芋播前对其种球进行预处理，定期考察使用种球包衣剂对魔芋出苗率、生长性状、软腐病发病率、植株死亡率及产量的影响，并利用RT-qPCR技术，对种植土壤中的魔芋软腐病菌进行定量检测，探究使用种球包衣剂对软腐病菌的抑制效果，进而为魔芋产业的绿色健康发展及魔芋软腐病的田间防治提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地点

本研究试验地位于云南省丽江市古城区七河乡西哨村，前茬种植大麦，上一年度种植魔芋。种植地块土壤类型为砖红壤，有机质为27.9 g/kg，pH值为6.04，土壤电导率为0.24 us/cm，有效氮为309 mg/kg，有效磷为78 mg/kg，有效钾为146 mg/kg。

1.2 供试药剂

种球包衣剂。原料组分：CuSO4·5H2O、(NH4)2HPO4、ZnSO4·H2O、Fe2O3、仿生脂氧合酶、改性淀粉、滑石粉。制备方法如下：取CuSO4·5H2O 70 g和(NH4)2HPO470g混匀，密封20 h后再加入ZnSO4·H2O 60 g、Fe2O380 g、仿生脂氧合酶0.2 g、改性淀粉220 g、滑石粉2800 g混匀，粉碎后过筛(120目)，然后再加入滑石粉8600 g混匀，制备成魔芋专用种球包衣剂。

77 %氢氧化铜可湿性粉剂(浙江瑞利生物科技有限公司生产)。

1.3 试验设计及试验地处理

试验共设置6个处理，每处理3次重复。处理1：液型魔芋种球包衣剂兑水，配制成100倍液，浸泡种球10 min，晾干备用；处理2：魔芋种球浸水后晾置5 min，并用固型魔芋种球包衣剂包裹均匀后备用；处理3：液型魔芋种球包衣剂兑水稀释成100倍100 kg液体，加入77 %氢氧化铜可湿性粉剂167 g混匀，浸泡种球10 min，晾干备用；处理4：魔芋种球浸水后晾置5 min，用固型魔芋种球包衣剂100 kg和77 %氢氧化铜可湿性粉剂167 g包裹均匀后备用；处理5：77 %氢氧化铜可湿性粉剂稀释为600倍液，浸泡种球30 min，晾干备用；处理6：魔芋种球不做任何处理(CK)。

播种时，试验地施用底肥2400 kg/hm2，底肥为腐植酸有机无机复混肥(N∶P∶K=10∶10∶15)。试验采用随机区组排列，3次重复，小区面积2.4 m×10 m=24 m2，高墒(墒面宽0.8 m)双行塘播，株行距30 cm×40 cm，每小区200株，种芋40～60 g。魔芋播种后第35天用20 %噻菌铜500倍液叶面喷施预防病害，间隔15 d同药同浓度再喷施1次。

魔芋种球经各处理后，分别播种于相应小区内，并于45 d后调查各小区种苗的出苗率。魔芋播种后45 d调查各小区的出苗率。

1.4 调查记录

于魔芋播种45 d时调查各处理植株出苗情况，第45、75和105天时调查各处理软腐病发病率及植株死亡率。收获时测定各小区魔芋产量。

1.5 魔芋软腐病菌种群数量分析

1.5.1 土壤总DNA的提取 于魔芋收获时采用5点取样法分别收集各处理种球周围的土壤样本，装入无菌保鲜袋并放置于4 ℃条件下保存，带回实验室备用。采用OMEGA 土壤DNA 提取试剂盒提取土壤微生物总DNA，提取方法参照操作说明。每个处理土样3次重复，提取的DNA溶液经Nanodrop超微量分光光度计和0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质量、浓度和片段长度，-20 ℃保存备用。

以稀释后的DNA为模板，选用515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增细菌16SrRNA基因V4 区，使用Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高保真酶进行PCR扩增。扩增产物用2 %琼脂糖凝胶进行检测；根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，使用GeneJET试剂盒回收产物[11]。

1.5.2 特异性引物优化 魔芋软腐病菌特异性引物为F3(5′-ATGCAACGCGAAGATCCTTAGGTAC-3′)和R3 (5′-CATTGAAGCACGTGTCTAGCCCTAC-3′)[12]，由上海生工生物工程股份有限公司合成，根据引物合成单上显示的退火温度±2 ℃范围确定适宜的退火温度。PCR扩增体系：Mix 12.5 μl，DNA 1 μl，引物各1 μl并混合，加ddH2O至25 μl。PCR 反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性18 s；58～62 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；35个循环；最后72 ℃延伸10 min，16 ℃保存备用。反应结束后，取5 μl反应产物，经1.5 %琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果经Blast 搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)后与GenBank数据库中相关种属的基因序列进行比对分析。

1.5.3 荧光定量PCR检测 采用Takara SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(CodeNo.RR820)进行PCR扩增。荧光定量PCR 扩增体系：SYBR.Premix.Ex.Taq.TMIImix 12.5 μl，DNA 2 μl，引物各0.75 μl并混合，加ddH2O至25 μl。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃条件下退火、延伸30 s，35个循环，收集荧光数据，4 ℃保存。采用含有目的基因的重组质粒建立标准曲线，测定提取质粒DNA的浓度，根据计算公式将质粒DNA的浓度换算成拷贝数，设置107、106、105、104、103、102CFU/mL 6个浓度梯度制作标准曲线，标准曲线要求R2>0.99。被测样品中病原菌含量根据仪器检测结果、抽提DNA 所用的样品质量、抽提获得的DNA 总量、配制qPCR 反应体系所用的模板量换算为每克土壤样品含有的病原菌含量，单位为copy number/g[13]。计算公式为：基因拷贝数=(6.02×1023copies/mol×质粒浓度g/μl)/MW g/mol，MW为双链DNA 的平均分子量，MW=碱基数×660/碱基。

1.6 数据分析处理

调查数据均采用Duncan新复极差法检验各处理间差异显著性，数据结果利用DPS 7.05统计软件计算分析，图用Sigma Plot 12.5绘制。

2 结果与分析

2.1 种球包衣剂对魔芋出苗率、株高的影响

6个处理魔芋种球的平均出苗率分别为92.00 %、96.00 %、93.20 %、97.50 %、90.50 %和87.00 %，各处理种球的出苗率差异较明显。分别于魔芋播种45、75和105 d全区随机取样调查魔芋株高，结果如表1所示，第45天时各处理间株高差异不显著(P>0.05)，第75和105天时各处理间株高差异显著(P<0.05)，3个时期均表现为处理4>处理2 >处理3 >处理1>处理5>处理6(CK)。试验结果表明，使用种球包衣剂能有效提高魔芋的出苗率和改善植株的生长性状。魔芋收获时测定各小区产量，6个处理魔芋产量分别为57.10、65.70、60.40、68.53、55.30和49.00 kg/24m2，各处理魔芋的产量差异较明显，表现为处理4>处理2 >处理3 >处理1>处理5>处理6(CK)；与处理6(CK)相比，使用种球包衣剂能显著提高魔芋的产量(P<0.05)。

表1 不同时期魔芋的出苗率、株高及产量

注：数据为平均值±标准误差。同一列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: The data are mean ± SD. Different small letters in the same column mean significant differences (P<0.05).

同一灰度柱状图上的小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

2.2 种球包衣剂对魔芋软腐病发病率和植株死亡率的影响

分别于魔芋播种45、75和105 d全区调查软腐病的发病率，结果如图1所示。试验结果表明，与空白对照相比，使用种球包衣剂能显著降低试验田魔芋软腐病的发病率(P<0.05)，防病效果表现为处理4>处理2 >处理3 >处理1>处理5>处理6(CK)；与液型包衣剂相比，固型包衣剂防治魔芋软腐病的效果要更显著(P<0.05)。播种45 d后的调查数据可知，魔芋种球经播前防病处理和不处理的发病率差异较显著(P<0.01)，空白对照的发病率是11.67 %，播前防病处理过的魔芋植株同期发病率分别为4.17 %、2.17 %、4.50 %、1.83 %、4.67 %，各处理间差异显著(P<0.05)；播种75 d后处理1、处理2、处理3、处理4、处理5和处理6(CK)魔芋软腐病发病率分别为7.50 %、4.00 %、7.00 %、3.33 %、11.33 %和16.67 %，各处理间差异显著(P<0.05)；播种105 d后各处理魔芋软腐病发病率分别为10.67 %、8.67 %、9.33 %、7.83 %、14.50 %和19.33 %，各处理间差异显著(P<0.05)。

分别于魔芋播种第45、75和105天全区调查植株死亡率，结果如图2所示。试验结果表明，使用种球包衣剂能显著降低试验田魔芋软腐病的死亡率(P<0.05)，防病效果表现为处理4>处理2 >处理3 >处理1>处理5>处理6(CK)；与液型包衣剂相比，固型包衣剂更能有效降低魔芋种苗的死亡率。播种45 d后的调查数据可知，各处理魔芋的死亡率分别为3.17 %、2.00 %、2.67 %、1.83 %、3.33 %和8.33 %，各处理间差异显著(P<0.05)；播种75 d后处理1、处理2、处理3、处理4、处理5和处理6(CK)魔芋的死亡率分别为4.50 %、2.50 %、5.00 %、2.33 %、6.50 %和10.67 %，各处理间差异极显著(P<0.01)；播种105 d后各处理魔芋的死亡率分别为7.83 %、5.33 %、8.17 %、4.17 %、8.67 %和15.33 %，各处理间差异显著(P<0.05)。

图2 不同调查时期魔芋植株的死亡率

2.3 魔芋软腐病菌RT-qPCR扩增及标准曲线的建立

基于RT-qPCR技术，在6个处理土壤样本中分别检测魔芋软腐病菌胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种的PCR产物，各处理基因拷贝数分别为187、124、164、109、228和257 bp(图3)。使用魔芋软腐病菌悬浮液作模板，可在浓度为1×103CFU/mL样品中检测到荧光信号，而RT-qPCR在5×104CFU/mL样品中发现荧光信号，表明RT-qPCR技术的检测灵敏度要高于PCR凝胶电泳的检测灵敏度。

选用特异性引物F3/R3对魔芋软腐病菌DNA的10倍梯度稀释液(5×102～5×107CFU/mL)进行RT-qPCR扩增，来验证RT-qPCR测定的准确性和精密度。扩增结束后，以魔芋软腐病菌DNA浓度为X轴，以Ct值为Y轴建立回归曲线，获得魔芋软腐病菌基因组DNA标准曲线。如图4所示，Ct值与魔芋软腐病菌DNA浓度呈负相关，标准曲线方程：y=-3.0657x+33.013，决定系数R2为0.9916。结果表明：使用魔芋种球包衣剂能有效抑制魔芋软腐病菌的繁殖和扩散，减少土壤中病原菌的有效含量。

图3 RTq-PCR电泳图谱

图4 魔芋软腐病菌基因组RT-qPCR标准曲线

3 讨 论

铜作为农作物的一种微量元素，同时其化合物又是一类重要的杀菌剂，在农业生产中的用途较广[14]。目前，铜制剂类杀菌剂是全球公认高效低毒、环境友好、不易产生抗药性的多作用位点杀菌剂，由于其附着能力较强，药效持久，可长时间阻止病原菌侵入植株体内，因而对细菌性病害和真菌性病害都有较好的防治效果[15-17]。本研究中，选用自行研制的种球包衣剂，其主要成分为CuSO4·5H2O、(NH4)2HPO4、ZnSO4·H2O、Fe2O3、改性淀粉和滑石粉，CuSO4·5H2O、(NH4)2HPO4和ZnSO4·H2O存在于同一环境中，会发生化学反应，生成两种蓝色、稳定的含铜化合物Cu[(NH4)2PO4]2、Cu(NH4)2PO4，Fe2O3作为一种染色剂，其在种球包衣剂内起到警戒色的作用，改性淀粉作为粘着剂，滑石粉作为填充剂。魔芋种球包衣剂的使用，能有效杀灭种芋上的病原菌，同时也能在一定程度上阻碍土壤中病菌对魔芋幼苗的侵染，起到较好的控病保苗作用。防治魔芋早期软腐病原菌的侵染是确保其稳定增收的重要节点, 魔芋种球包衣剂在魔芋产业中可作为一项常规使用技术。

本研究采用液型种球包衣剂、固型种球包衣剂和77 %氢氧化铜可湿性粉剂，分别在魔芋播种前对种球进行预处理，定期观察魔芋出苗率、生长性状、软腐病发病率、植株的死亡率及产量，结果表明使用种球包衣剂魔芋的出苗率、生长性状和产量均有显著变化，表明种球包衣剂具有促进发芽生长和增产丰收的作用；魔芋软腐病的发病率及植株的死亡率均表现：固型种球包衣剂+77 %氢氧化铜可湿性粉剂>固型种球包衣剂>液型种球包衣剂+77 %氢氧化铜可湿性粉剂>液型种球包衣剂>77 %氢氧化铜可湿性粉剂>CK。种球包衣处理对魔芋苗期生长和软腐病的前期防控具有显著作用，且不同的播前处理方式，对魔芋苗期软腐病的防治效果均不同，固型包衣剂在魔芋块茎上的附着量较大，因而其药效持续时间更长；液型包衣剂在魔芋块茎上形成较薄的保护层，与固型包衣剂相比，其药效持续时间短且保护作用相对较弱；使用77 %氢氧化铜可湿性粉剂处理魔芋种球，只对种球表面附着的病原菌有效，且作用单一。此外，使用魔芋种球包衣剂，除防病外还能为植株提供P、K等多种微量元素，对魔芋的苗期生长提供了良好条件。从6个处理魔芋软腐病发病率调查结果可知，包衣技术和传统杀菌处理对初期软腐病防控效果较好，但随时间延长其防控效果减弱。因此，在魔芋生长的中、后期尚需要加强田间管理，应用化学农药或生物农药对魔芋软腐病进行有效防控，才能最终达到丰产稳产的目的。本研究采用RT-qPCR技术对不同处理土壤中的魔芋软腐病菌进行定量检测，探究使用种球包衣剂对软腐病菌的抑制效果。同一田间管理模式下，与空白对照相比，使用种球包衣剂能显著减少土壤中魔芋软腐病菌的数量，起到抑制病害发生蔓延的作用。

4 结 论

魔芋播种前使用种球包衣剂，能有效减少耕作土壤中魔芋软腐病菌的数量，并显著降低魔芋软腐病的发病率和植株的死亡率。