基于光密度法的蛋白酶电泳定量评价胃蛋白酶的功效

邢晟，梁翠荣，巩丽萍，石峰，吴秀芸，王禄山

(1.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101；2.山东大学微生物技术国家重点实验室<微生物技术研究院>，，山东 青岛 266237)

胃蛋白酶于1836年由泰奥多尔·施旺(Theodor Schwann)发现，是一种疗效确切的助消化药，中国、美国、欧洲等药典均有收载。临床用于因食蛋白性食物过多所致消化不良、病后恢复期消化功能减退以及慢性萎缩性胃炎、胃癌、恶性贫血而导致的胃蛋白酶缺乏等症。根据《中国药典》2015年版(二部)[1]，胃蛋白酶提取自猪、羊或牛的胃黏膜，每克胃蛋白酶中含蛋白酶活力不得少于3 800单位。胃蛋白酶在胃酸参与下将蛋白质分解成蛋白胨及少量多肽，主要用于消化不良、食欲缺乏等[2-3]。

目前对胃蛋白酶功效评价的主要方法为《中国药典》2015年版中的效价测定方法[4]，另外常采用的方法有福林酚法等[5-6]。这些方法均通过紫外-可见分光光度法测定底物与酶反应过程中底物量的减少或产物量的增加直接或间接表征酶的活性。然而，该方法无法检测样品中胃蛋白酶的实际含量，无法反映胃蛋白酶的比酶活，因此可能引入低质量胃蛋白酶(比活力低，杂蛋白多)投料的风险。如何快速直观的同时针对酶活性及比酶活两个指标开展酶的功效评价是目前技术发展的主要需求。明胶-SDS-聚丙烯酰胺凝胶(gelatin-SDS-PAGE)的蛋白酶活性分析方法可直接在电泳胶上准确地鉴定出具有蛋白酶活性的蛋白带，从而了解其特性。此法具有灵敏度高、结果直观、检测方便等优点，因而得到广泛的应用，并不断被改进[7-8]。然而，该方法目前仅能对具有蛋白酶活性的成分进行定性分析，而无法定量，同时该方法通过复性电泳展示蛋白酶活性，在一定程度上影响了酶的原始活性状态，不能相对客观地反映样品中酶的实际功效状态，为此，我们采用光密度分析方法，结合活性电泳技术对这一方法进行了改进，并针对胃蛋白酶开展了相关分析。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 仪器：Bio-Rad Mini-Protean Tetra Cell电泳槽；Bio-Rad Power PacTM Basic电泳仪；1.0 mm玻璃板；离心机；恒温培养箱；脱色摇床等。

对照品：胃蛋白酶(批号：SLBQ3760V，分子量35kDa)，购自Sigma公司；血清白蛋白(牛)(来源：中检院，批号：140619-201622，蛋白含量：23.5 mg/瓶)；蛋白质MarkerⅣ(14.4～116 kDa，批号：C600525，上海生工公司)。试剂：水为Millipore Q-POD制备的纯化水，其他试剂均为分析纯。样品：4个生产厂家的胃蛋白酶原料。

1.2 样品溶液制备 选取胃蛋白酶生产企业提供的4份原料药，分别命名为YL1～YL4。

原料溶液制备：精密称取原料50 mg，置100 mL量瓶中，加入pH 3.0磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，制成含胃蛋白酶0.5 mg·mL-1的溶液，涡旋震荡使混匀，置4 ℃冰箱中冷藏待用(当日使用)。

标准工作液：分别取Sigma胃蛋白酶适量，置于10 mL量瓶中，加入pH 3.0磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，制成含胃蛋白酶0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·mL-1的溶液备用。

2 试验方法

2.1 常规法比酶活测定 蛋白质含量测定参照《中国药典》2015年版(四部)通则0731蛋白质含量测定第二法福林酚法(Lowry法)。胃蛋白酶效价测定参照《中国药典》2015年版(二部)胃蛋白酶项下的效价测定方法。测得的效价结果与蛋白质含量结果的比值即为比酶活(IU·mg-1)。

2.2 SDS-PAGE 试验过程参考SDS-PAGE经典方法[9]，其中分离胶配方(10 mL 10%)：40% 聚丙烯酰胺贮液2.5 mL，1.5 mol·L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH 8.8)2.5 mL，10% 过硫酸铵 0.1 mL，10% SDS 0.1 mL，四甲基乙二胺(TEMED)10 μL，补水至10 mL。浓缩胶配方(5 mL 5%)：40% 聚丙烯酰胺贮液0.625 mL，1.0 mol·L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH 6.8)0.63 mL，10% 过硫酸铵 0.05 mL，10% SDS 0.05 mL，四甲基乙二胺(TEMED)5 μL，补水至5 mL。样品与5×上样缓冲液(每10 mL含0.6 mL 0.5 mol·L-1pH 6.8 Tris-HCl；5 mL 50%甘油；1 mL 1%溴酚蓝；0.5 mL β-巯基乙醇；1 mL 10% SDS；1.9 mL蒸馏水)按4∶1比例混合均匀。上样10 μL，起始电压60 V，待样品中的溴酚蓝前沿进入分离胶后调电压至120 V，电泳结束后使用1%考马斯亮蓝R250染色液染色，之后使用脱色液(乙酸-乙醇-水=1∶1∶8)脱色，进行图像扫描处理。

2.3 Native-PAGE 试验过程参考相关文献方法[10]，样品与5×上样缓冲液(每10 mL含0.6 mL 0.5 mol·L-1pH 6.8 Tris-HCl；5 mL 50%甘油；1 mL 1%溴酚蓝；3.4 mL蒸馏水)按4∶1比例混合均匀。上样10 μL。电泳分离胶浓度均为10%。电泳全程4 ℃冰浴，起始电压60 V，待样品中的溴酚蓝前沿跑入分离胶后调电压至120 V，电泳结束后使用1%考马斯亮蓝R250染色液染色，之后使用脱色液(乙酸-乙醇-水=1∶1∶8)脱色，进行图像扫描处理。

2.4 蛋白酶电泳 样品中的蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得到分离，整个电泳过程在冰浴条件下进行，样品中的蛋白酶活性得以完整保留。电泳结束后，用pH 3.0磷酸盐缓冲液漂洗2次，除掉凝胶表面的杂质，每次5 min，再置于预先于40 ℃恒温水浴保温的1%酪蛋白的pH 3.0磷酸盐缓冲液中，轻微振摇使凝胶完全浸入，40 ℃恒温2 h，用pH 3.0磷酸盐缓冲液漂洗2次，1%考马斯亮蓝R250染色液染色20 min后脱色。将凝胶扫描形成TIF格式图像，分辨率300 dpi。

在这一过程中，具有一定粒径的酪蛋白分子进入凝胶，在酶促反应温度下，凝胶中的胃蛋白酶将进入的酪蛋白分子水解，反应结束后，通过考马斯亮蓝染色液使残留在凝胶中的酪蛋白染色，脱色后，背景中胃蛋白酶水解圈的光密度值与蛋白酶效价成正比。胃蛋白酶条带的光密度值与蛋白质含量成正比，测得的效价结果与蛋白质含量结果的比值即为比酶活。通过与确定比酶活的对照品(Sigma)比较，最终确定供试品的比酶活(IU·mg-1)。

2.5 光密度分析 数字化与定量分析的关键是数据提取和有效分析处理[11]。具体处理过程如下：对经过扫描的电泳凝胶图像进行简单泳道标记后，切去浓缩胶部分，将图像转换为光密度图像。不同试验批次的凝胶存在的微小差异可通过质控泳道经Image J进行均一化处理，主要处理内容包括图像尺寸统一，以质控泳道为依据的光密度校正等。之后对图像中的电泳条带进行光密度数据的提取和分析，最后进行相关的计算和分析统计。数据提取和分析过程使用的软件主要包括：①Photoshop： Adobe公司推出的大型图像处理软件，主要用于图像的处理和优化；②Image J：基于Java的图像处理软件，由National Institutes of Health开发(https://imagej.nih.gov/ij/)。

3 结果

3.1 光密度方法验证 为验证电泳图像光密度数据与蛋白质浓度的相关性，取“1.2”项下的系列标准工作溶液电泳并进行数据提取分析，电泳结果如图1所示。

按照“2.5”项下操作方法对电泳光密度数据进行提取校正(0.01 mg·mL-1对应泳道1浓度过低，无有效提取信息，根据上样量计算约为80 ng)，提取数据如表1。

表1 胃蛋白酶标准工作液电泳图光密度提取值

对提取数据进行线性回归分析，结果如图2所示。如图所示，胃蛋白酶标准工作液电泳所对应的光密度与样品蛋白质浓度成良好的线性关系，采用光密度分析方法可行。

3.2 药典方法测定原料比酶活 按照“2.1”项下方法测定结果见表2。

表2 药典方法测定比酶活

测定结果显示，4批胃蛋白酶原料的蛋白质含量均在70%以上，其中YL4蛋白质含量较高，达80.9%。4批胃蛋白酶原料比酶活在11～14 IU·mg-1之间，YL3最高，达13.6 IU·mg-1。现有药典方法无法准确测定原料的纯度。

3.3 光密度法测定原料比酶活及纯度 取4批胃蛋白酶原料适量，溶于pH 3.0磷酸盐缓冲液中，制成含胃蛋白酶0.5 mg·mL-1的溶液，涡旋震荡使混匀，按照“2.3”项下方法进行电泳，结果如图3所示。

由图中可见，除胃蛋白酶条带外，不同原料中均存在一定量的其他杂质蛋白质，对胃蛋白酶以及其他杂质蛋白的光密度数据提取后进行胃蛋白酶纯度分析，结果见表3。

原料中胃蛋白酶含量占总蛋白质含量的比例均在75.0%～85.0%之间，其中YL3和YL4中胃蛋白酶纯度较高。结合常规方法测定的胃蛋白酶原料蛋白含量，4批胃蛋白酶原料实际含胃蛋白酶比例见表4。

表3 胃蛋白酶原料纯度

表4 原料实际含胃蛋白酶量

综合结果，YL4中实际含有胃蛋白酶比例最高，达68.42%，YL2中实际含有胃蛋白酶比例最低，为55.49%，原料中实际含胃蛋白酶浓度将影响厂家投料量及产品杂质含量。

为分析原料中实际活性成分的比例，采用蛋白酶电泳法进行比酶活分析，结果见图4。

由图4可以清晰地看到胃蛋白酶条带周边有明显的水解圈，对胃蛋白酶以及水解圈的光密度值进行提取，并与Sigma标准品结果比较即可测定不同原料的比活力(经测定，Sigma胃蛋白酶比活为149 IU·mg-1)，具体结果见表5。

结果显示YL4比酶活最高，为35.22 IU·mg-1，通过常规方法测定的结果中，YL4的比酶活同样是最高的，但数值只有13.6 IU·mg-1，两者相差一倍多，这是因为通过光密度法测定的比酶活反映的是原料中实际效价与总胃蛋白酶的比值，药典方法测定的比酶活是实际效价与总蛋白质(包含胃蛋白酶和其他杂质蛋白)的比值。另外，原料中可能存在的酚类以及糖类对福林酚法的影响会进一步降低药典方法的测定结果，进而增加两种方法的差距。可见光密度法相对药典方法，更加准确，专属性更强。

表5 胃蛋白酶原料比酶活

注：胃蛋白酶含量(mg)=胃蛋白酶光密度/(Sigma光密度/Sigma浓度);实际效价(IU)=水解圈光密度/(Sigma水解圈光密度/Sigma实际效价)

4 讨论

本文建立的蛋白酶电泳方法，在完整保留功能蛋白质活性的基础上，通过改良处理方式及分析方法，定量分析酶组分的变化。为最大限度地保持样品活性，采用的Native-PAGE过程必须在冰浴中进行。为确保试验结果的稳定性与重现性，严格控制酶促反应时间、底物浓度、缓冲液pH值以及染色时间等试验条件的一致，并且对图像进行统一的标准化处理。与复性电泳技术相比，该方法能够完全保持样品中的酶活性，并能够同时检测具有相同底物降解能力的不同酶组分。检测灵敏度高于考马斯亮蓝R250染色方法，与硝酸银染色方法的灵敏度相当[10]。

与标准检验结果相比较，通过蛋白酶电泳法测定的效价结果反映了样品中的实际功效成分，能够更加直接的反应样品中胃蛋白酶的功效及质量，具有较好的应用前景。通过调整电泳方法和染色技术，该方法可应用在包括糖苷酶等可用于医药行业的酶制剂的分析研究中。