寻常型银屑病皮损组织中浆细胞样树突状细胞和TLR7/9通路表达的研究

2020-04-28 09:25汤怡周强韩睿陆威陶小华程浩
浙江医学 2020年6期
关键词:真皮层银屑病皮损

汤怡 周强 韩睿 陆威 陶小华 程浩

银屑病是一种常见的以红斑、鳞屑为主要表现的慢性炎症性皮肤病,其中以寻常型银屑病最为多见。虽然寻常型银屑病很少危及生命,但其反复发作、迁延不愈的病程以及严重脱屑的皮损危害患者的身心健康,严重影响患者的生活质量[1-2]。目前认为,银屑病是Th1细胞介导相关的自身免疫性疾病,与遗传、环境、病毒感染等相关[3-4]。近年来,临床越来越关注用天然免疫来解释环境触发和自身免疫T细胞级联相互作用在银屑病发病中的作用[5-7]。浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid den-dritic cell,pDC)是最近发现的具有特征性的树突状细胞的一个亚类。在机体内,pDC能够产生大量的α干扰素(IFN-α)和白细胞介素 12(IL-12),同时 IFN-α 诱导所有T细胞亚类上调IL-12受体,进一步与IL-12共同激活Th1反应,活化下游Toll样受体(toll like receptor,TLR)信号通路TLR7、TLR9,白细胞介素1受体相关激酶 1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK-1),干扰素调节因子 7(interferon regulatory factor 7,IRF7)[8-9]。目前,pDC在寻常型银屑病皮损组织中的表达情况和具体分布与疾病相关性尚不明确。基于此,本研究通过免疫组化方法检测寻常型银屑病皮损组织中pDC的特异性表面标志分子CD2AP、CD123和TLR7、TLR9及其信号通路中相关蛋白分子IRAK-1、IRF7的表达情况,探讨pDC和TLR7/9信号通路在寻常型银屑病发病机制中的作用,现报道如下。

1 材料和方法

1.1 皮损组织 选取浙江省人民医院皮肤科于2017年1至12月收集的19例寻常型银屑病患者的皮损组织和皮损旁正常组织为研究材料,患者均符合临床寻常型银屑病诊断标准。其中男12例,女7例;年龄26~50(39.84±8.00)岁;病程 0.5~18 年,中位 7(3,11)年;主要皮损部位为膝背侧、四肢伸侧。所有患者均排除病毒性肝炎、自身免疫性疾病、结核及糖尿病等可能影响机体免疫力的疾病。本研究经医院医学伦理委员会批准,患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂 兔抗人CD2AP单抗、鼠抗人CD123单抗均购自美国Abcam公司,兔抗人IRAK-1单抗、兔抗人IRF7单抗、鼠抗人TLR7单抗、兔抗人TLR9单抗均购自美国CST公司。免疫组化用过氧化氢、抗原修复液、HRP偶连二抗、DAB显色液均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CD2AP、CD123、IRAK-1、IRF7、TLR7、TLR9 免疫组织化学染色 分别取19例寻常型银屑病患者的局部皮损组织和对应的皮损旁正常组织,经4%多聚甲醛固定后制成石蜡切片,并进行4 μm的连续切片。免疫组化流程如下:首先取组织样于60℃烘箱烘30min使蜡融化,依次放入二甲苯-梯度乙醇-水中脱腊浸水;再加入过氧化氢消除内源性的过氧化物酶;随后利用抗原修复液修复抗原,经过透膜、封闭后加入稀释好的一抗(兔抗人CD2AP单抗1:100稀释、鼠抗人CD123单抗1:100稀释、兔抗人IRAK-1单抗1:50稀释、兔抗人IRF7单抗1:200稀释、鼠抗人TLR7单抗1:50稀释、兔抗人TLR9单抗1:100稀释)孵育过夜。次日取出后洗去一抗,加入HRP二抗室温孵育。之后利用DAB显色,苏木素染核,封片观察并记录结果。

1.3.2 免疫组化染色结果判定 CD2AP、CD123、TLR7、TLR9、IRF7和IRAK-1染色观察:光镜下细胞膜和(或)细胞质呈现棕黄或黄褐色颗粒的细胞为阳性细胞,阳性率=含阳性细胞的病例数/总病例数×100%。半定量计分:400倍光镜下观察拍照,表达的强度采用基于染色强度和阳性细胞百分率的半定量评分法。强度评分(A):未染色计0分;淡黄色计1分;棕黄色计2分;深棕色计3分。阳性细胞率评分(B):阳性细胞率<33%计1分;33%~66%计2分;>66%计3分。表达强度为A×B。每张切片取5个视野进行观察评分量化,最终取平均值进行比较。

1.4 统计学处理 采用SPSS20.0统计软件。非正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示,两组比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以频数和构成比表示,两组比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 寻常型银屑病皮损组织CD2AP的表达及分布情况 CD2AP主要表达于皮肤组织真皮层的单核细胞,表皮层内也有少量表达,以细胞质为主,见图1(插页)。CD2AP+细胞在皮损组织表皮层中的阳性率明显高于皮损旁正常组织表皮层(P<0.05),同时CD2AP的表达强度明显高于皮损旁正常组织(P<0.05);同样的,CD2AP+细胞在皮损组织真皮层中阳性率明显高于皮损旁正常组织(P<0.05),CD2AP的表达强度明显高于皮损旁正常组织(P<0.05),见表1。

图1 CD2AP在寻常型银屑病皮损组织中的表达及分布情况(DAB染色,×400)

2.2 寻常型银屑病皮损组织中CD123的表达及分布情况 CD123同样主要表达于真皮层的单核细胞,表皮层内有少量表达,以细胞质为主,见图2(插页)。CD123+细胞在皮损组织表皮层中的阳性率明显高于皮损旁正常组织(P<0.05),CD123的表达强度明显高于皮损旁正常组织(P<0.05);同样,CD123+细胞在皮损组织真皮层中的阳性率明显高于皮损旁正常组织(P<0.05),CD123的表达强度明显高于皮损旁组织,见表2。

图2 CD123在寻常型银屑病皮损组织中的表达及分布情况(DAB染色,×400)

2.3 寻常型银屑病皮损组织中TLR7的表达及分布情况 TLR7主要表达于皮损组织真皮层中,以细胞质为主,见图3(插页)。TLR7+细胞在皮损组织表皮层中的阳性率(47.4%)与皮损旁正常组织(21.1%)比较无统计学差异(P>0.05);而在皮损组织真皮层中TLR7+细胞的阳性率(42.1%)高于皮损旁正常组织(0.0%,P<0.05)。

图3 TLR7在寻常型银屑病皮损组织中的表达及分布情况(DAB染色,×400)

表1 CD2AP在寻常型银屑病皮损组织和皮损旁正常组织中的细胞阳性率和表达强度比较

表2 CD123在寻常型银屑病皮损组织和皮损旁正常组织中的细胞阳性率和表达强度比较

2.4 寻常型银屑病皮损组织中TLR9的表达及分布情况 TLR9在寻常型银屑病真皮层和表皮层中均有表达,以细胞质为主,见图4(插页)。TLR9+细胞在皮损组织表皮层中的阳性率(89.5%)明显高于皮损旁正常组织(10.5%,P<0.05);而在皮损组织真皮层中TLR9+细胞的阳性率(100.0%)明显高于皮损旁正常组织(10.5%,P<0.05)。

图4 TLR9在寻常型银屑病皮损组织中的表达及分布情况(DAB染色,×400)

2.5 寻常型银屑病皮损组织IRAK-1的表达及分布情况 IRAK-1主要表达于皮损组织真皮层中,表皮层可见少量零星表达,以细胞质为主,见图5(插页)。IRAK-1+细胞在皮损组织表皮层的阳性率(31.6%)高于皮损旁正常组织(0.0%,P<0.05);在皮损组织真皮层中IRAK-1+细胞的阳性率(100.0%)明显高于皮损旁正常组织(26.3%,P<0.05)。

图5 IRAK-1在寻常型银屑病皮损组织中的表达及分布情况(DAB染色,×400)

2.6 寻常型银屑病皮损组织IRF7的表达及分布情况 IRF7在皮损组织真皮层和表皮层均有表达,主要在细胞质分布,见图6(插页)。IRF7+细胞在皮损组织表皮层的阳性率(47.4%)明显高于皮损旁正常组织(0.0%,P<0.05);IRF7+细胞在皮损组织真皮层阳性率(73.7%)明显高于皮损旁正常组织(0.0%,P<0.05)。

图6 IRF7在寻常型银屑病皮损组织中的表达及分布情况(DAB染色,×400)

3 讨论

寻常型银屑病是一种Th1细胞介导相关的自身免疫性疾病,会影响遗传易感人群的皮肤[10]。近年来,人们越来越关注先天免疫在解释环境触发因素和导致寻常型银屑病的自身免疫性T细胞级联反应加剧之间的作用[11-12]。研究发现,pDC通过产生IFN-α,驱动寻常型银屑病皮肤中自身免疫T细胞的活化和扩增,从而导致寻常型银屑病的发展。基于此,本研究通过pDC的经典标志物CD2AP和 CD123来标记寻常型银屑病组织中pDC的数量,结果显示,寻常型银屑病皮损组织中pDC数量明显增加,且大部分存在于真皮组织中。

此外,本研究进一步探究了pDC通过什么信号通路发挥功能。有报道提示pDC是最有潜力的Ⅰ型IFN(IFN-a/β)分泌细胞,而IFN-α可以诱导T细胞发生Th1型分化信号的异常激活及活化TLR信号通路[13-14]。因此,本研究检测了TLR信号通路TLR7/9、IRAK-1、IRF7在寻常型银屑病皮损组织中的表达,结果显示,TLR7/9、IRAK-1、IRF7在寻常型银屑病皮损组织中均存在异常高表达的情况。这提示抑制pDC的招募以及TLR信号通路在寻常型银屑病的发病过程中发挥着重要的作用,其中的作用机制需要后续进一步探究。

综上所述,本研究发现在寻常型银屑病皮损组织中pDC数量明显增加,同时TLR信号通路(TLR7/9、IRAK-1、IRF7)也有部分活化。这提示pDC的异常增多与TLR信号的异常活化对寻常型银屑病的发生、发展起一定作用,相关后续的机制研究将为针对性地治疗寻常型银屑病提供理论依据和新的方向。

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