金莲花汤抗流感病毒活性研究△

王腾宇，刘斯琪，丁鹏敏，刘双月，王青青，庞月笙，胡秀华，王如峰

北京中医药大学 生命科学学院，北京 102488

金莲花汤是2003年国家中医药管理局公布的预防非典型肺炎的处方，由大青叶(Isatidis Folium)、葛根(Puerariae Radix)、蒲公英(Taraxaci Herba)、苏叶(Perillae Folium)和金莲花(Trollii Flos)按照一定比例组成，可用于风温病的治疗。中医认为流行性感冒(简称流感，中医称“时行感冒”)是由风热温邪引起，为机体正气亏虚，外感疫毒之邪(“疠气”)夹时令之气乘虚而入、中伤机体所致[1]，也属于风温病的范畴，故金莲花汤也可用于流行性感冒的治疗。西医则认为流感是流感病毒引起的急性呼吸道感染[2]，是一种传染性强、传播速度快的疾病，对于流感的治疗关键是抗流感病毒[3]。因此，金莲花汤用于治疗流感应该与其抗流感病毒活性有关。

中药复方是在中医理论指导下，按“辨证施治”的原则，根据“君臣佐使”关系由多味单味药组成[4]。对于中药组方的研究需要从多方面对其进行探索和研究，其中拆方是研究中药复方组方原理的重要手段之一[5]。对金莲花汤进行拆方研究，可以了解组成金莲花汤的各单味药对全方的抗病毒活性的贡献度，从而证明组方的合理性。

1 材料

1.1 细胞系、病毒株

细胞系选择狗肾细胞(MDCK)，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心(Cell Resource center，IBMS，CAMS/PUMC)，经本实验室传代后冻存备用。病毒株为甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1)，由中国预防医学科学院病毒研究所提供，经本实验室鸡胚扩增、测定滴度后冻存备用。

1.2 仪器及试药

CO2培养箱[MCO-18AIC(UV)，Sanyo]，倒置荧光相差显微镜(TS2000-S，Nikon)，移液器(20/200/1000 μL，Corning)。

DMEM(Gibco)，胎牛血清(FBS)(Gibco)，胰酶(Hyclone)。研究用中药购自河北安国药材市场，经北京中医药大学王如峰教授鉴定为正品，大青叶为蓼科植物蓼蓝PolygonumtinctoriumAit.的干燥叶，葛根为豆科植物野葛Puerarialobata(Wild.) Ohwi的干燥根，蒲公英为菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.干燥全草，苏叶为唇形科植物紫苏Perillafrutescens(L.) Britt.的干燥叶，金莲花为毛莨科植物金莲花TrolliuschinensisBunge的干燥花。连花清瘟胶囊(批号：A1601075)为石家庄以岭药业股份有限公司产品，利巴韦林片(批号：20160601)为北京双鹭药业股份有限公司产品，两者均购自北京金象大药房花家地店。

2 制备

2.1 试药制备

称取蒲公英37.5 g、金莲花15 g、大青叶25 g、葛根25 g，加适量蒸馏水浸没药材，浸泡30 min，微沸煎煮15 min，然后加入苏叶15 g，继续微沸煎煮15 min，收集滤液，再次加入适量蒸馏水浸没药材，大火煎煮30 min，收集合并2次滤液，得到金莲花汤全方试药。

称取蒲公英37.5 g、金莲花15 g、大青叶25 g、葛根25 g，加适量蒸馏水浸没药材，浸泡30 min，微沸煎煮30 min收集滤液，再次加入适量蒸馏水浸没药材，大火煎煮30 min，收集并合并2次滤液，得到缺苏叶试药[6]。

称取蒲公英37.5 g、金莲花15 g、大青叶25 g，加适量蒸馏水浸没药材，浸泡30 min，微沸煎煮15 min，然后加入苏叶15 g，继续微沸煎煮15 min，收集滤液，再次加入适量蒸馏水浸没药材，大火煎煮30 min，收集并合并2次滤液，得到缺葛根试药。

称取蒲公英37.5 g、金莲花15 g、葛根25 g，加适量蒸馏水浸没药材，浸泡30 min，微沸煎煮15 min，然后加入苏叶15 g，继续微沸煎煮15 min，收集滤液，再次加入适量蒸馏水浸没药材，大火煎煮30 min，收集并合并2次滤液，得到缺大青叶试药。

称取蒲公英37.5 g、大青叶25 g、葛根25 g，加适量蒸馏水浸没药材，浸泡30 min，微沸煎煮15 min，然后加入苏叶15 g，继续微沸煎煮15 min，收集滤液，再次加入适量蒸馏水浸没药材，大火煎煮30 min，收集并合并2次滤液，得到缺金莲花试药。

称取金莲花15 g、大青叶25 g、葛根25 g，加适量蒸馏水浸没药材，浸泡30 min，微沸煎煮15 min，然后加入苏叶15 g，继续微沸煎煮15 min，收集滤液，再次加入适量蒸馏水浸没药材，大火煎煮30 min，收集并合并2次滤液，得到缺蒲公英试药。

称取蒲公英37.5 g、金莲花15 g、大青叶25 g、葛根25 g、苏叶15 g，分别加适量蒸馏水浸没药材，浸泡30 min，微沸煎煮30 min收集滤液，再次加入适量蒸馏水浸没药材，大火煎煮30 min，收集并合并2次滤液，分别得到蒲公英、金莲花、大青叶、葛根、苏叶试药。

将上述试药浓缩至0.5 g·mL-1，冷冻干燥，4 ℃冷藏备用。

2.2 溶液制备

2.2.1磷酸缓冲溶液(PBS)制备 精密称取0.20 g KCl、8.00 g NaCl、0.20 g KH2PO4、3.90 g Na2HPO4·12H2O，溶解于1 L超纯水中，用4% NaOH调节pH至7.2～7.4，分装，高温高压灭菌，室温冷却，标记，4 ℃保存备用。

2.2.2胰酶制备 精密称取胰酶粉末0.10 g溶解于200 mL PBS中，加入酚红指示剂，调节pH至8.0左右，再加入乙二胺四乙酸(EDTA)0.04 g，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用。

2.2.3MTT溶液制备 精密称取MTT粉末0.25 g，溶解于50 mL PBS中，注意避光，超声溶解。溶解完全后以0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用。

2.2.4培养基制备 不完全DMEM培养基：取培养基粉末1袋(1 L规格)，加入1 L超纯水，磁力搅拌器搅拌使其完全溶解，再加入1.98 g NaHCO3，调节pH至7.2～7.4，0.22 μm无菌过滤器过滤除菌，4 ℃保存备用。

细胞生长液(完全DMEM培养基)：不完全DMEM培养基中加入10%胎牛血清(FBS)、1%非必需氨基酸、1%青链霉素，4 ℃保存备用。

细胞维持液：不完全培养基中加入2%胎牛血清(FBS)、1%非必需氨基酸、1%青链霉素，4 ℃保存备用。

病毒生长液：不完全DMEM培养基中加入胰酶，最终胰酶质量浓度为6.6 μg·mL-1。

细胞冻存液(现用现配)：不完全DMEM培养基中加入20% FBS和8% DMSO，混匀。

2.2.5供试品溶液制备 分别称取上述试药和连花清瘟胶囊粉末各4.0 mg，加入细胞维持液4 mL，配制质量浓度为1 mg·mL-1的试药，溶解充分，0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，对半稀释得到不同稀释度的试药，质量浓度分别为：1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.80、3.90、1.95 μg·mL-1，4 ℃保存备用。

3 方法

3.1 病毒毒力检测

将处于对数期的MDCK细胞按照1.0×105个/mL接种到96孔板上，每孔100 μL，继续于37 ℃、5% CO2培养箱中培养约24 h至细胞长成单层。弃去96孔板中培养基，用PBS清洗细胞2次。用病毒生长液将病毒按照10倍倍比稀释为不同浓度，分别加入上述长成单层细胞的96孔板中，每孔100 μL(n=8)。设置正常对照组，放入37 ℃、5% CO2恒温恒湿培养箱中吸附2 h后，弃去病毒液，加入病毒生长液100 μL，继续置于培养箱中培养。每天观察细胞病变情况，直到细胞不再出现新的病变。显微镜下观察并记录每个稀释倍比下出现细胞病变的孔数，记录细胞病变效应(CPE)。按照Reed & Muench法计算病毒半数致死量(TCID50)[7]。

3.2 供试品细胞毒性检测

将对数期的MDCK细胞按照1.0×105个/mL接种到96孔板上，每孔100 μL，继续于37 ℃、5% CO2培养箱中培养约24 h至细胞在96孔板底部长成单层。弃去细胞培养基，将对半稀释后不同浓度的试药分别加入上述长成单层细胞的96孔板中，并设置空白对照组(n=8)。培养72 h，弃去含药培养基，PBS清洗2次，每孔加入0.5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL，混匀。继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使96孔板底部结晶充分溶解。用酶标仪检测每孔的吸光度(A)值，检测波长为490 nm。根据测得的A值，按照公式(1)计算细胞存活率，利用SAS 9.30进行数据处理和统计学分析[8]。

细胞存活率=A实验/A细胞对照×100%

(1)

3.3 体外抗病毒实验

将对数期的MDCK细胞按照1.0×105个/mL接种到96孔板上，每孔100 μL，继续于37 ℃、5% CO2培养箱中培养约24 h至细胞在96孔板底部长成单层。弃去细胞培养基，用PBS清洗细胞2次。将剂量为100 TCID50的病毒接种于已长成单层的MDCK细胞的96孔培养板上，在培养箱内吸附2 h。弃去病毒液，加入按照各个试药共同无毒浓度稀释得到的试药，继续培养72 h。设置阳性药组(利巴韦林、连花清瘟胶囊)，正常细胞对照组(阴性对照)、病毒对照组(空白对照)，每组8个平行孔。连续观察3 d，观察CPE。弃去含药培养基，每孔加入0.5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL，混匀。继续在相同条件下培养4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使96孔板底部结晶充分溶解。用酶标仪检测每孔的吸光度(A)值，检测波长为490 nm。根据测得的A值，按照公式(2)计算药物抗病毒有效率(ER)[9]。

ER=(药物处理组平均A值-病毒对照组平均A值)/

(细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值)×100%

(2)

4 结果

4.1 TCID50

采用致细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)观测方法对流感病毒半数致死量进行判断，结果见表1。

表1 流感病毒感染MDCK细胞CPE

由表1可知：能使半数细胞病变的病毒稀释度在10-2～10-3，按照Reed & Muench公式计算：

距离比例=

(75%-50%)/(75%-47.1%)=0.90

(3)

log0.1(TCID50)≥50%细胞病变的病毒稀释对数+距离比例，即log0.1(TCID50)≥2+0.90=2.90。

TCID50=10-2.9，即病毒原液稀释10-2.9倍时，达到其TCID50。本实验采用100倍TCID50进行实验。

4.2 供试品细胞毒性

测定供试品各个稀释度对MDCK细胞存活率的影响(见表2)，结果显示不同供试品对MDCK的生长活性有不同影响，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各试药对MDCK细胞的最大无毒质量浓度 μg·mL-1

由表2可知，全部试药的共同无毒质量浓度为62.5 μg·mL-1， 为了排除药物本身对实验的影响，故选用该浓度进行实验。

4.3 金莲花汤及拆方各试药抗病毒有效率

本实验测定了金莲花汤及拆方各个试药和连花清瘟胶囊的抗病毒有效率。阳性药利巴韦林组[质量浓度为2 μg·mL-1，抗病毒有效率为(65.43±0.05)%]显示出抗病毒活性，说明该抗病毒模型可信。结果显示，金莲花汤具有一定的抗病毒活性，抗病毒有效率为(75.13±0.04)%，其抗病毒活性与连花清瘟胶囊[抗病毒有效率为(73.21±0.03)%]接近，差异无统计学意义(P>0.05)；单味药中抗病毒有效率最高的是大青叶，抗病毒有效率为(88.40±0.07)%，其次为葛根，抗病毒有效率为(74.27±0.06)%，然后依次为蒲公英、苏叶、金莲花，抗病毒有效率依次为(45.20±0.05)%、(32.20±0.07)%、(-3.26±0.09)%；在缺少1味药的试药中，缺少苏叶的抗病毒有效率最高，为(51.67±0.01)%，缺金莲花、缺蒲公英、缺大青叶、缺葛根组抗病毒有效率依次下降，分别为(28.22±0.06)%、(23.03±0.10)%、(-17.87±0.07)%、(-21.03±0.04)%。如图1所示，葛根和连花清瘟胶囊与全方对比，差异无统计学意义(P>0.05)，其余各试药与全方对比，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

5 讨论

本研究按照传统用药习惯，采用减药法对金莲花汤水煎液进行抗病毒活性拆方研究。结果显示金莲花汤具有良好的抗病毒活性，其抗病毒强度与连花清瘟胶囊接近。连花清瘟胶囊为现阶段成熟的上市药品，其抗病毒效果明显[10]，因此提示金莲花汤也有开发成良好的抗流感病毒药物的潜力。

根据实验结果，在试药的共同无毒质量浓度(62.5 μg·mL-1)下，大青叶和葛根抗流感病毒活性较强，对全方的活性贡献度较大，而蒲公英、金莲花、苏叶抗流感病毒活性相对较弱，对全方的活性贡献度相对较小。葛根和大青叶的单煎液的抗流感病毒活性是单味药中最强的，且与全方相似或高于全方，而两者的缺味方的抗流感病毒活性明显低于全方。虽然蒲公英、金莲花、苏叶对全方的活性贡献度相对较小，但是，缺任何1味药的金莲花汤缺味方的抗病毒效果都比全方差。这说明各单味药在金

注：各试药与全方对比，*P<0.05；**P<0.01。图1 金莲花汤及拆方各试药抗病毒有效率

莲花汤中都不可或缺，也证明了金莲花汤的组方合理性。

根据文献报道，大青叶有良好的抗病毒活性，其对甲型流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、登革病毒、乙型脑炎病毒、腮腺炎病毒等均有很好的抑制作用[11]，这与本研究的结果基本一致。虽然葛根单味药的抗病毒活性未见报道，但是其富含异黄酮类化合物，主要成分葛根素具有解热、镇痛、抗菌、抗感染、降血压、降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、解酒等作用[12]。同时，文献报道葛根芩连汤具有较好的抗轮状病毒作用，加味葛根汤对临床治疗风寒表实证感冒效果良好[13-15]，说明葛根在病毒感染性疾病中可能起重要作用。

根据文献报道，金莲花确实具有抗病毒活性[16-17]。虽然在本研究中金莲花单味药表现出的抗流感病毒活性较差，但是其缺味方的活性明显弱于全方，说明金莲花对于全方的抗病毒贡献必不可少。至于金莲花单味药在本研究中抗病毒活性较差的原因，我们推测可能与实验浓度有关。这也间接印证了中药复方的整体化协同作用方式，其具体机制值得进一步研究。