DNA甲基转移酶1在乳腺癌患者中的表达及意义*

潘小平 洪晓绿 孟 萍 裴德翠 程延东 姚明媚 王 蓉

已有研究证实内皮素-3(EDN-3)基因在乳腺癌患者中表达显著减少[1]，其原因是该基因DNA启动子发生了甲基化[2]，而DNA甲基化过程是由DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)催化完成。目前研究发现的DNMT家族(DNMTs)成员至少包括DNMTl、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，本文检测60例乳腺癌患者外周血中DNMTl表达水平，旨在分析不同乳腺癌患者DNMTl表达水平差异及临床意义，为DNMTl的临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018-04-01—2018-11-30在本院接受手术治疗的乳腺癌患者60例(实验组)，年龄36-85岁，平均(54.3±12.0)岁，其中>50岁患者36例，≤50岁患者24例。病理TNM分期按照第7版分类标准[3]，肿瘤大小：T115例，T217例，T317例，T411例；淋巴结转移：N019例，N118例，N215例，N38例；远处转移：无远处转移(M0)47例，远处转移(M1)13例。其它临床病理特征，ER受体：阴性28例，阳性32例；PR受体：阴性28例，阳性32例；组织学等级：G110例，G225例，G325例。实验组患者临床病例资料完整，术前未行任何特殊治疗，所有患者于术前2h采集外周血2ml于EDTA抗凝管中，-20℃冰箱保存。另选同期体检健康女性50例作为对照组，年龄23-74岁，平均(43.8±14.0)岁，两组间年龄差异无统计学意义(t=1.542，P=0.726)，采集对照组测试者清晨空腹外周血2ml于EDTA抗凝管中，-20℃冰箱保存。待所有样本收集完成后批量检测。

1.2 主要仪器及试剂

Trizol(9109，Invitrogen)，DNase (M610A，Promega)，总蛋白提取试剂盒(C510003，上海生工)，BCA蛋白定量试剂盒(弗德生物，杭州)，SYBR RT-PCR试剂盒(RR820A ，TaKaRa)，逆转录试剂盒(RR047A， TaKaRa)，荧光定量PCR仪(CFX96，BIO-RAD)，X 射线摄影暗匣(AX-Ⅱ)，Mini型蛋白电泳系统(Bio-rad，美国)，数码凝胶图像分析系统(LG2000)，RT-6000自动酶标仪(RT-6000，深圳雷杜)。

1.3 RT-PCR检测DNMT l mRNA水平

于-20℃冰箱取出待检血液样本，室温复融后参照Invitrogen公司的Trizol试剂盒说明书提取实验组和对照组外周血单个核细胞总RNA，使用DNase 试剂提纯；紫外分光光度仪测定A260/A280值在1.8-2.0之间，纯度较高；琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带均清晰可见，RNA抽提较完整条带；采用TaKaRa公司逆转录试剂盒获得cDNA，-80℃保存备用；使用TaKaRa公司的试剂盒进行RT-PCR，DNMT1上游引物：5' TGA AGC CCG TAG AGT GGG AA 3'，下游引物：5' CTC TTG AAC GCT TAG CCT CTC C 3'，以GAPDH作为对照，上游引物：5'GAT TCC ACC CAT GGC AAA TT3'，下游引物：5' GAT TCC ACC CAT GGC AAA TT 3'，扩增条件：95℃3min，然后95℃5s，60℃30s，共40循环。设定溶解曲线程序：95℃ 15s，60℃30s，95℃15s，反应结束仪器自动生成溶解曲线图。以倍比稀释的cDNA作为模板，检测DNMT1与GAPDH的扩增效率相近，采用2-△△Ct法计算其相对表达量，其中△CT=CT目的基因-CT内参基因，△△CT=△CT-△CT对照组最大值， 每个样品重复3次，取平均Ct值。

1.4 Western blot检测DNMT1蛋白

两组全血标本1 500r/min离心15min，分离血浆，利用总蛋白提取试剂盒提取血浆总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定样本总蛋白浓度，每孔30 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳(浓缩胶：60-100V，30min，分离胶：100-200V，60min)，切下含有目的蛋白的胶条转至PVDF膜(300mA，120min)，室温封闭1-2h，TBST洗膜后加兔抗人DNMT1 IgG抗体(BIOSS 1∶2 000)；内参加入兔抗人GAPDH抗体(abcam 1∶2 000)，4℃孵育过夜后，分别加HRP标记羊抗兔IgG抗体(SANTA CRUZ 1∶4 000)室温孵育2h，显色1-5min后洗片，显影，IPP6.0软件行灰度扫描分析。以DNMT1蛋白条带灰度值与GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示DNMT1蛋白的相对表达量。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 实验组与对照组DNMT1 mRNA和蛋白表达比较

实验组DNMT1 mRNA相对表达量较对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；实验组DNMT1蛋白表达较对照组显著性升高，差异亦有统计学意义(P<0.01)，见表1，图1。

表1 两组间DNMT1 mRNA和蛋白表达量比较

注：与对照组比较，1)P<0.01

图1 两组DNMT1蛋白表达(Western blot,1-4号位置对应实验组标本，5-8号位置为对照组标本)

2.2 不同临床参数乳腺癌患者DNMT1 mRNA和蛋白表达比较

在不同临床参数的乳腺癌外周血中，DNMT1 mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同临床特征乳腺癌患者DNMT1 mRNA和蛋白表达量比较

3 讨 论

乳腺癌是常见的恶性肿瘤，全球每年约有120万女性罹患此疾病，且其发病率以每年2%的速度递增[4]，严重危害女性身心健康。乳腺癌的发生与多种因素有关[5]，某些DNA发生甲基化改变，可能是乳腺癌易感因素之一，包括BRCA1[6]、PITX2[7]、CAM-1[8]基因等，已有研究证实EDN-3基因甲基化与乳腺癌的发生发展密切相关[2]。

DNA甲基化是一种表观遗传修饰，在肿瘤基因表达调控，细胞增殖分化等方面起重要作用，并与肿瘤的发生密切相关，已证实DNA甲基化与许多肿瘤相关，如膀胱癌[8]、肺癌[9]、肠癌[10]等，也包括乳腺癌[11]。研究发现，DNA甲基化过程是由DNMT催化S-腺苷蛋氨酸上的甲基转移至胞嘧啶含氮杂环5，位上的修饰反应，是负责将甲基基团添加至CpG二核苷酸的酶[12]，该酶与肿瘤的发生密切相关[13]。目前研究发现的DNMT家族(DNMTs)成员至少包括DNMTl、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。

DNMTl是以复制病灶为靶点的最丰富的DNA甲基转移酶，并且在细胞分裂过程中起最主要的、稳定的维持甲基化状态作用[14]。DNMTl可以在DNA复制之后利用亲代甲基化模式作为模板，通过甲基化子代DNA链维持CpG甲基化[15]。已有报道，DNMTl表达增加在肺癌[16]、胃癌[17]、肾细胞癌[18]等恶性肿瘤中起重要作用。

本研究显示DNMTl mRNA和蛋白在乳腺癌外周血中过表达，较对照组显著升高，表明DNMTl过度表达可增加乳腺癌的发病风险，这与Xiang等[19]的研究相似。DNMT1在乳腺癌中能导致许多抑癌基因发生甲基化，如P53[20]、APC、PTEN[21]等，也可使正常基因发生甲基化，如内皮素-3[2]、BRCA1[22]、TET1[23]等，从而导致乳腺癌发生。然而，在乳腺癌不同临床特征的比较中，发现DNMTl mRNA和蛋白与肿瘤大小、组织类型、有否淋巴结转移及远处转移等特征间均无统计学差异(P>0.05)，提示DNMTl基因的过表达虽与乳腺癌致癌过程密切相关，但与乳腺癌的发展、转移无关，该结论与Pathania等[24]的研究类似，但KAR 等[25]证实乳腺癌发生转移者DNMT1表达水平高于未发生转移者，这与本文研究的结论大不相同，产生不同结论的可能原因为：(1)纳入的乳腺癌人群不一样，可能存在基因表达上的差异；(2)统计方法可能存在差异，导致结果不一致；(3)本研究收集的每种分类的病例数较少，可能会对结果产生偏倚。然而，DNMTl在乳腺癌组织中的表达如何，是本团队后续亟待研究的内容。

综上所述，DNMTl在乳腺癌患者外周血中高表达，其与乳腺癌的发生密切相关，提示临床工作中，可将DNMTl作为乳腺癌的辅助检查之一，能为乳腺癌的筛查与诊断提供帮助。

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