BDM支架“人工羊膜”的制备及立体培养的初步实验研究

李会兴，赵 菁，尤孟媛，任峻青，韩 磊，肖雁冰

(遵义医科大学附属妇幼保健院 妇科，贵州 遵义 563000)

宫腔粘连(Intrauterine adhesions,IUA)是妇科常见病[1]，严重影响女性生殖健康和生育能力，是造成继发不孕的主要因素之一[2-4]。以宫腔粘连分离术(Transcervical resection of adhesion,TCRA)为主的综合治疗是IUA最主要的治疗手段[5]，其中，TCRA术后人新鲜羊膜(Fresh human amniotic membrane, hFAM)宫腔移植具有较大优势[6-8]，但是，由于hFAM干细胞含量少，同时存在法律、安全和取材等问题，限制了其临床应用。

研究表明[9-11]，内源或外源性干细胞是子宫内膜损伤修复的基础，因此，从“从仿生学”角度，模似hFAM制备富含干细胞的“人工羊膜(Artificial amniotic membrane,AAM)”，对其生物活性、力学性能、转化效果、材料降解和免疫原性等问题进行系列研究，并不断加以改进，就有可能最终制备出可以弥补hFAM不足的人工羊膜制品，为治疗IUA提供新的思路与方法。

本研究是制备AAM的初步研究，采用羊膜间充质干细胞(Human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)、BD-基质胶(BD-matrigel,BDM)、 DMEM/F12结合，体外制备AAM，并将其置于三维立体培养体系中进行培养，研究hAMSCs能否在AAM存活并具有增殖活性，为后续研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 DMEM/F12培养基、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购于美国GIBCO公司，BDM购自BD公司，长期冷冻保存于-20 ℃呈固体状，0℃为液体状，室温下迅速成胶。AnnexinV-FIFC细胞凋亡试剂盒、ELISA试剂盒购自RD公司。胎盘收集于遵义市妇幼保健院产科正常足月分娩的6名健康产妇，无妊娠并发症，并获得产妇及家属的同意。本研究获本院医学伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 间充质干细胞分离提取及培养 将羊膜剪至1 mm大小碎片后，加入0.25%胰蛋白酶消化2次，每次30 min。加入Ⅱ型胶原酶消化1 h，室温下(20 ℃)收集细胞滤液，离心机1 000 rpm离心5 min，弃上清，收集hAMSCs，重悬于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(含100 U/mL 青链霉素)中，37 ℃恒温孵育。培养液每2天更换1次，当细胞融合达到80%时，0.25%胰蛋白酶消化，1∶3传代。本实验均采用3代的细胞。

1.2.2 人工羊膜的制备及分组 无血清DMEM/F12培养基按1∶3稀释BD基质胶后分装入冻存管。实验前冰浴融化预先分装的BD基质胶，于冰上将培养的hAMSCs与基质胶(浓度为50 μL/ cm2生长面积的基质胶)按1∶1混合注入24孔板中，制成底面积为2 cm2、厚度约3～5 mm、细胞浓度为3×105/ mL的圆形薄膜，即“人工羊膜”。37 ℃培养箱放置30 min使其成胶后，加入适量 DMEM/F12 完全培养基，隔天换液。其中二维培养组为对照组，人工羊膜组即三维组为实验组。同一孕妇胎盘来源的hAMSCs分别接种于观察组和对照组的一个孔内，共6组。

1.2.3 形态学观察 自细胞培养起，分别在第1、4、7天应用倒置相差显微镜对细胞的生长、形态等情况进行动态追踪观察，对比两组细胞的形态学改变。

1.2.4 流式细胞术进行细胞存活率检测 通过消化、吹打、离心、重悬等步骤分别收集对照组(不含BD基质胶)和实验组约1×105个的间充质干细胞，用AnnexinV-FIFC/PI细胞凋亡试剂盒进行染色，计算AnnexinV-FIFC/PI阳性细胞比例，并检测细胞凋亡。

1.2.5 ELISA测定血管内皮生长因子的表达 对照组和实验组细胞以同等密度种植在6孔板中，加入DMEM/F12培养48h，收集其培养基，室温下(20℃)离心机1 500 rpm离心5 min并储存在4℃。用酶联免疫吸附试验试剂盒测定血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度。

2 结果

2.1 人羊膜间充质干细胞的表型鉴定 第3代培养的hAMSCs细胞表面CD44、CD73、CD90以及CD105呈高表达，而CD45/34/11b/19/HLA-DR呈低表达，符合间充质干细胞的标志(见图1)。

图1 hAMSCs细胞表面抗原的表达情况

2.2 “人工羊膜”的整体外观 第3代hAMSCs与BDM按体积1∶1混合，制作成底面积为2 cm2、厚度为3～5 mm、细胞浓度为3×105/mL的圆形均匀薄膜，即“人工羊膜”(见图2)。

图2 “人工羊膜”的整体外观

2.3 不同组别间充质干细胞的形态学观察 第3代培养的hAMSCs细胞形态学观察发现，对照组hAMSCs 3～4 h开始贴壁，48 h左右细胞呈完全贴壁生长，7 d时细胞融合达90%，光学显微镜下可观察到呈均一长梭形的间充质干细胞(见图3A)。实验组hAMSCs则表现为均匀分布，呈不规则球形生长(见图3B)。两组细胞生长状态良好，漂浮细胞数量少。

A：对照组细胞培养第7天；B：实验组细胞培养第7天。图3 hAMSCs细胞形态

2.4 对照组与实验组hAMSCs凋亡率及VEGF平均表达量的比较 细胞凋亡率的比较，经过Annexin-V FITC染色后，流式细胞仪结果显示对照组与实验组hAMSCs凋亡率分别为4.91%、2.90%(P<0.05)，差异有统计学意义(见图4、表1)。采用ELISA法对VEGF的表达进行比较，结果显示：对照组细胞与实验组细胞VEGF的表达量分别为(616.58±18.01) pg/mL和(579.91±38.94) pg/mL，经检验，两组差异无统计学意义(P=0.063,见表1)。

A：对照组；B：实验组。图4 流式细胞术检测hAMSCs细胞凋亡

组别细胞凋亡率(%)VEGF(pg/mL)对照实验4.91±1.352.90±0.96Δ616.58±18.01579.91±38.94

与对照组比较， Δ：P<0.05。

3 讨论

本研究结果显示，将含有DMEM/F12培养基的hAMSCs悬液与BDM按体积1∶1混合制成的“人工羊膜”外观透明，常温下呈近似果胶冻状(见图2)；镜下见：hAMSCs均匀分布，呈不规则球形生长，且生长状态良好，细胞形态更加接近于间充质干细胞原有特点，这种特征可能更有利于hAMSCs经体外大规模培养后维持细胞的干性(见图3B)，为后续AAM向子宫内膜定向转化的研究提供更具有“干性”的hAMSCs；对照组hAMSCs呈均一长梭形生长(见图3A)。鉴于VEGF在创伤修复和血管再生过程中发挥重要作用[12-13]，本研究通过检测VEGF在蛋白水平的表达量，来对比二维和三维状态下hAMSCs的分泌能力，发现三维条件下生长的hAMSCs与二维条件下VEGF的表达量无显著差异，提示以BDM支架并不影响hAMSCs原有的分泌功能(见表1)。流式细胞术检测两组hAMSCs的凋亡率结果显示三维生长细胞的凋亡率低于二维对照组(见图4、表1)，提示在BDM支架中hAMSCs的存活比例更高，产生这种现象的原因可能是hAMSCs在以BDM为支架的三维空间结构中能形成更多的细胞间联系，有利于细胞的存活，具体机制值得进一步研究。

细胞三维培养技术目前已臻成熟，可用于三维培养的生物基质材料有水凝胶、胶原、明胶、基质胶等[14-17]，这些材料常被用于对细胞形态、生化功能、迁移和基因表达等方面的研究[18-19]。有研究表明[20]，将生长状态良好的P3 hAMSCs接种于自组纳米短肽水凝胶中，然后对支架材料中的hAMSCs生长、增殖以及干性基因表达情况等进行研究，结果显示hAMSCs呈圆球形分散分布，干性基因表达上调，表明三维培养更有利于hAMSCs干性的维持；但增殖能力有所减弱，原因可能与水凝胶内部多肽链结构有关。本研究实验组干细胞也展示了相似的生长特征，也证明了干细胞在三维与二维培养条件下确实存在异质化的表现形式。

近年来有研究报道了人新鲜羊膜(Human fresh amniotic membrane, hFAM)宫腔移植在预防再粘连中的应用，但疗效不一，虽然对中、重度IUA患者TCRA术后粘连及月经情况均在一定程度上得到了改善，但总体效果不佳[21-24]。主要原因在于单位面积内hFAM内hAMSCs含量较少，而干细胞的多少与内膜修复效果直接相关[11,25-26]。本研究证明了hAMSCs在BDM中可以良好的存活，但AAM质地呈近似“胶冻”状，几乎没有韧性及抗拉能力，不能满足下一步转化实验、尤其是后续动物实验研究。导致这种现象的原因可能有两个方面，一是含有DMEM/F12的细胞悬液对BDM的稀释作用；二是BDM在与细胞悬液吹打混匀时在一定程度上破坏了其内部结构。因此，想制备出能用于后续研究的AMM，须在确保AAM中hAMSCs数量和活性的前提下进一步改良AMM，使其达到相应的韧性及抗拉能力以满足后续实验要求，目前，团队正在着手改进AAM生物力学性能的研究。

本研究表明hAMSCs在以BDM为支架的人工羊膜中能够存活，并具有良好的生物学活性，初步验证“人工羊膜”的设想是可行的。在后续研究中，我们将从生物材料及结构组成上对AAM进行改良，以增强AAM的生物力学性能，为后续动物实验提供实验理论依据。