负载硒蛋白果胶微凝胶的制备、结构表征及体外消化特性研究

董 琦,徐 威,张 碟,蔡 杰,*,程水源, 胡中泽,丁文平,祝振洲,于 添,邓绍南

(1.武汉轻工大学国家富硒农产品加工技术研发专业中心,湖北省绿色富硒农产品精深加工工程技术研究中心,湖北武汉 430023;2.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023;3.武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉 430023;4.国家富硒产品质量监督检验中心,湖北恩施 445000;5.恩施德源健康科技发展有限公司,湖北恩施 445000;6.湖北楠柏生态农业发展有限公司,湖北恩施 444315)

硒(Se)作为生物体内必需的微量元素,具有重要的生物学作用,其中有机硒相对于无机硒具有更高的吸收、利用率与更强的生物活性[1-2]。植物有机硒主要以硒蛋白、硒酶、硒核糖核酸以及硒多糖等形式存在,且硒蛋白为大分子有机硒的主要形态[3],具有抗氧化作用与增强免疫力[4],对白内障、糖尿病、癌症及心血管等疾病的防治具有一定功效[5]。肖颜颜等[6]利用不同剂量富硒大麦苗对小鼠进行灌胃,通过小鼠细胞免疫与体液免疫测定试验,证实了富硒大麦苗能有效提高小鼠细胞免疫与体液免疫的功能。张卓等[7]将脱脂富硒花生干粉中的蛋白质进行分离,并研究了其对DPPH自由基清除能力,结果表明高硒含量蛋白具有更高的还原力和更长的诱导时间。胡玲玲等[8]分别对糙米和富硒发芽糙米中的蛋白进行提取,并分析比对其抗氧化活性,研究结果表明富硒糙米蛋白抗氧化能力(羟自由基(·OH)实验)与芦丁和VC相当,但明显高于普通于糙米蛋白。杜润峰等[9]进一步以富硒糙米蛋白为原料酶解制备抗氧化肽,并对进行抗氧化性能评估,结果表明其抗氧化能力显著高于同等条件下非富硒糙米蛋白酶解物。因此,富有机硒食品的研究与开发在我国具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

从高聚硒植物中提取硒蛋白用于特色食品富硒强化是一种有效的加工方法。然而,植物硒蛋白有特殊气味,使其在富硒食品加工中应用受限。此外,为了减少硒蛋白在胃部的破坏,实现其缓释、靶向输送以及高生物利用度,成为了富硒功能食品研究的热点。国内外学者在此相关领域开展了研究工作。例如,杨飞等[10]利用滴加法制备了负载牛乳血清白蛋白(BSA)的壳聚糖-果胶微胶囊,其能够有效包埋BSA且显著延长了释放时间,明显改善了缓释效果。陈莎等[11]采用自组装技术制备缓释BSA-橘皮果胶三维网络结构复合水凝胶,其在模拟胃肠溶液消化实验中对所包埋的红景天苷具有一定的缓释效果。刘佳炜等[12]分别采用明胶和改性明胶对木瓜蛋白酶进行包埋,所制备的明胶-壳聚糖-海藻酸钠凝胶能有效提高固定化酶的酶活力,其中以改性明胶为原料的效果更明显。Encina等[13]利用喷雾干燥法制备卵磷脂-鱼油微胶囊来改善鱼油的氧化稳定性,并研究了喷雾干燥过程中溶剂的使用对微胶囊的影响。本课题组系统研究了复合酶法化优化研制多孔淀粉微胶囊,并用于负载橄榄油制备粉末油脂,在改善液体油使用方便性的同时提高了其存储稳定[14-15]。以食品材料为壁材,借助其物化性质包埋负载生物活性物质,可以在一定程度上形成“庇护”效应。上述研究为硒蛋白包埋与活性保护提供了借鉴思路,但目前关于硒蛋白微胶囊的研究鲜有报道。

鉴于此,本文以植物硒蛋白生物活性为模型、柑橘果胶为微胶囊壁材,利用凝聚特性构建负载硒蛋白果胶微凝胶,并系统研究了微凝胶的制备工艺,同时采用扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶红外光谱仪(FTIR)、热重分析仪(TGA)以及模拟胃肠液消化试验进一步对其结构表征及体外消化特性探讨,旨在为硒蛋白在富硒食品加工中的稳定性与生物利用研究提供理论依据,为富有机硒食品的开发提供一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物硒蛋白 由国家富硒农产品加工技术研发专业中心(武汉轻工大学)提供;柑橘果胶(半乳糖醛酸含量65%,酯化度15%) 上海源叶生物科技有限公司;胃蛋白酶、胰酶 Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司;氯化钙 天津科密欧化学试剂有限公司;盐酸、氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司。

Vario EL Cube元素分析仪 德国元素分析系统公司;FD5-2.5冷冻干燥机 西盟国际集团金西盟(北京)有限公司;SB-5200DTN超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;TGL16冷冻离心机 长沙英泰仪器有限公司;S-3000N扫描电子显微镜 日立仪器(上海)有限公司;NEXUS670傅里叶红外光谱仪 美国尼高力仪器公司;TGA/DSC/1100SF热失重分析仪 梅特勒-托利多仪器(上海)公司。

1.2 实验方法

1.2.1 负载硒蛋白果胶微凝胶的制备 微凝胶制备意图如图1所示。精确称取0.05 g硒蛋白与一定浓度果胶溶液混匀,在一定温度条件下超声作用20 min后,倒入同样温度的一定浓度的CaCl2溶液中混合均匀,期间不断搅拌以充分反应形成凝胶,抽滤洗涤,除去表面的硒蛋白,将凝胶取出在-20 ℃冰箱中预冻后置于冷冻干燥机中干燥,经研磨过250目筛,得到负载硒蛋白果胶微凝胶。采用上述步骤制备未包埋硒蛋白的果胶微凝胶作为对照样品。

图1 负载硒蛋白果胶微凝胶的制备[16]

1.2.2 单因素实验 经预试验确定果胶和CaCl2溶液浓度(w/v)、包埋操作温度为需优化因素,并选取浓度和温度范围,具体方法如下:

果胶添加量对包埋率的影响:称取一定量的果胶以浓度为3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%的比例溶于10 mL去离子水,加入0.05 g硒蛋白,置于20 ℃超声波清洗机中作用20 min,倒入10 mL相同温度的质量分数为3.0%的CaCl2溶液,重复1.2.1中步骤,得负载硒蛋白果胶微凝胶,用元素分析法测定氮元素含量,计算包埋率及载硒量。

包埋操作温度对包埋率的影响:称取0.05 g硒蛋白,与浓度4.5%的果胶分别在10、20、30、40、50 ℃超声波清洗机中作用20 min,之后倒入相同温度的浓度为3.0%的CaCl2溶液,重复1.2.1中步骤,得负载硒蛋白果胶微凝胶,用元素分析法测定氮元素含量,计算包埋率及载硒量。

CaCl2添加量对包埋率的影响:称取一定量的CaCl2以浓度为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的比例溶于10 mL去离子水。配制浓度为4.5%的果胶溶液,添加0.05 g硒蛋白,置于20 ℃超声波清洗机中作用20 min,加入不同浓度的CaCl2溶液。重复1.2.1中步骤,得负载硒蛋白果胶微凝胶,采用元素分析法测定氮元素含量,计算包埋率及载硒量。

1.2.3 微凝胶制备工艺的正交试验 综合单因素实验结果,确定因素水平优化范围,选用L9(34)正交表,对果胶包埋硒蛋白结果进行验证。

表1 正交试验因素水平表

1.2.4 包埋率和载硒量的计算 采用元素分析法测定:准确称取负载硒蛋白果胶微凝胶质量m1,每份样品添加硒蛋白(蛋白质含量40%)质量m2；分别取(5±0.25) mg负载硒蛋白果胶微凝胶和硒蛋白原料,基于元素分析测定样品中氮元素百分比N1,计算包埋率T。利用原子荧光光谱法测定硒蛋白中硒含量C1[17],进而计算样品中载硒量:

1.2.5 微胶囊结构表征

1.2.5.1 微观形貌分析 将硒蛋白、负载硒蛋白果胶微凝胶和空白果胶微凝胶,用导电胶固定到样品台上,经真空镀金后,使用扫描电子显微镜(SEM)对样品进行表面微观结构观察。

1.2.5.2 红外光谱分析 采用傅里叶红外光谱仪(FTIR)通过KBr压片法测定硒蛋白、负载硒蛋白果胶微凝胶和空白果胶微凝胶的分子结构,范围4000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,扫描16次。

1.2.5.3 热稳定分析 称取5 mg硒蛋白、负载硒蛋白果胶微凝胶和空白果胶微凝胶,采用热重分析仪(TGA)在N2气氛中(流速为20 mL/min),以10 ℃/min的加热速率从30 ℃升温至800 ℃观察其热失重质量变化。

1.2.6 胃肠道缓释性能研究 制备人工胃液、肠液,模拟消化累计释放试验[18-19]:采用最佳工艺制备的包埋硒蛋白的微凝胶和空白微凝胶,各分为9份,每份称取0.2 g样品,置于锥形瓶中,在锥形瓶中加入10 mL的模拟胃液(pH2.0),于(37±0.50) ℃恒温摇床中振荡,振荡速度为 100 r/min,定时取出一份样品,匀浆机10000 r/min破碎搅匀,4000 r/min离心10 min,取上清液用Bradford蛋白浓度试剂盒测定样液中的硒蛋白含量,模拟胃液消化2 h后,取出剩余的样品,在样品中加入10 mL的模拟肠液,继续消化,定时取出样品,测定样品中的硒蛋白含量n,以相对释放率对时间绘制出释放曲线。

1.3 数据处理

每组实验重复3次。采用SPSS 19.0处理数据,显著性水平为P<0.05,作图采用Origin 9.0版本。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 果胶浓度对包埋率的影响 如图2所示,果胶浓度在3.5%～4.0%时,包埋率略有上升,而由4.0%增加至5.0%时,包埋率迅速上升,当果胶浓度超过5.0%时,包埋率基本不变。这是由于在Ca2+浓度不变的前提下,果胶分子的增加,会提高网络缔合区数目,使凝胶更加紧密,从而提高包埋率。在果胶浓度5.0%～5.5%,分子间氢键会不断加强,但同时疏水相互作用同比增加[20],粘度增大,包埋硒蛋白不够均匀,使得包埋率没有提高。

图2 果胶浓度对包埋率的影响

以每克样品中载硒量为指标时,由于制备每份样品添加的硒蛋白质量一定,当果胶浓度为3.5%时,每份样品的质量较小,1 g样品所取用样品份数较多,相应硒蛋白添加量会更多,故而载硒量计算值较高。当果胶浓度达到5.5%时,每份样品质量较大,1 g样品中硒蛋白添加量会较少,于是出现载硒量先下降后上升,再下降的趋势。因此选择5.0%作为制备负载硒蛋白果胶微凝胶的最佳果胶浓度。

2.1.2 包埋操作温度对包埋率的影响 由图3可知,从10～50 ℃之间负载硒蛋白果胶微凝胶包埋率逐步增大,这是因为随着温度的升高,能够提高果胶与Ca2+的聚合反应,加快凝胶速率,30～50 ℃增加程度小于10～30 ℃,并且趋于平缓,可能是因为包埋是一个放热过程,当温度升高后微凝胶的形成受阻[21]。考察载硒量,与包埋率的增长趋势基本一致。因此选择30 ℃为最适包埋温度。

图3 包埋操作温度对包埋率的影响

2.1.3 CaCl2浓度对包埋率的影响 由图4可知,负载硒蛋白果胶微凝胶包埋率在1.0%～2.0%呈增大趋势,这是因为低酯果胶分子链间的羧基与Ca2+形成离子键形成更有网络空间结[22-23],当Ca2+浓度增大时,能够有效的形成凝胶,将硒蛋白包裹,提升包埋率。在2.0%～5.0%逐渐降低,可能是因为Ca2+浓度继续增大时,三维结构开始收缩[20],凝胶强度逐渐变弱,在洗涤干燥过程中造成硒蛋白的流失;当CaCl2浓度在2.0%时,包埋率达到最大值。载硒量趋势和包埋率相同,故而在实验中选择2.0%的CaCl2浓度作为最优浓度。

图4 CaCl2浓度对包埋率的影响

2.2 微凝胶制备的正交试验

正交试验结果见表3，方差分析见表4,可知，因素A显著、因素B、C不显著,负载硒蛋白果胶凝胶工艺的因素影响顺序为:A>C>B,即果胶浓度>CaCl2浓度>包埋操作温度。得到最佳实验因素水平为A2B2C2,但该组合不在此正交实验中。根据此条件重新实验,制备样品,测得其包埋率为66.3%±1.64%,载硒量为(308±8.71) μg/g,高于正交试验中的最优组合,进而确定包埋的最佳工艺为果胶浓度为5.0%,包埋操作温度为30 ℃,CaCl2浓度2.0%。经过果胶微凝胶包埋后,硒蛋白的特殊气味得到了有效掩盖。

表3 果胶包埋硒蛋白的正交试验结果

表4 方差分析

2.3 微凝胶结构表征

2.3.1 微观形貌分析 利用SEM对样品的微观形貌进行表征。从图5a、图5b可以看出硒蛋白呈均匀球形,果胶凝胶研磨之后为光滑片状。利用果胶形成微凝胶对硒蛋白进行包埋之后,由图5c明显可以看到果胶微凝胶表面明显凹凸不平,但未出现破裂现象,有圆球状物质被紧密包裹,证实了硒蛋白成功被包埋,形成了负载硒蛋白果胶微凝胶。

图5 扫描电子显微镜图

2.3.2 红外光谱分析 在硒蛋白质包埋入果胶微凝胶的基础上,进一步借助FTIR分析分子官能团的差异。图6展示了硒蛋白、空白果胶微凝胶和负载硒蛋白果胶微凝胶的红外谱图。对比硒蛋白和负载硒蛋白果胶微凝胶的红外谱图,880 cm-1附近有吸收峰,可能是Se与蛋白形成共价键;1240 cm-1处的吸收峰为酰胺III带,为蛋白质特征峰,是C-N的伸缩振动和N-H的弯曲[24],而空白果胶微凝胶无该峰。对比空白果胶微凝胶和负载硒蛋白果胶微凝胶的红外谱图发现,在1030和1100 cm-1有吸收峰,为糖苷键和呋喃环的骨架C-O和C-C振动带,这是多糖在指纹区的特征吸收峰[25]。负载硒蛋白果胶微凝胶同时显现出芯材和壁材的特征峰,说明硒蛋白和果胶微凝胶发生了作用,制成的果胶微凝胶成功负载了硒蛋白。这与SEM研究结论相一致。

图6 负载硒蛋白果胶微凝胶红外光谱图

2.3.3 TGA分析 通过在N2氛围下进行热失重分析,考察硒蛋白和微凝胶的热分解行为。如图7所示,TGA曲线直观显示了硒蛋白、果胶微凝胶和负载硒蛋白果胶微凝胶的热性能变化。从图中可以看出,当温度从30 ℃升至100 ℃时,硒蛋白质量下降8.2%,这是由于样品中水分的减少。而果胶微凝胶和负载硒蛋白果胶微凝胶分别下降15.6%、14.8%,这可能是因为果胶微凝胶在冻干后具有强吸水性。随着温度的升高,在100～132 ℃之间硒蛋白的加热失重线进入一个平台区,之后分解速率开始急剧上升,这是因为硒蛋白开始热分解,而果胶微凝胶和负载硒蛋白果胶微凝胶热分解相对缓慢。当温度继续上升至552 ℃,硒蛋白质量损失达71.4%,而果胶微凝胶和负载硒蛋白果胶微凝胶失量损为58.8%、60.8%,由此可以说明硒蛋白果胶微凝胶被成功包埋,且果胶微凝胶致密保护膜的包裹有利于硒蛋白热稳定性。

图7 负载硒蛋白果胶微凝胶热重分析曲线图

2.4 胃肠缓释性能研究

由图8可知,果胶凝胶包埋硒蛋白的样品在模拟胃液中消化2 h,累计释放了6.1%的硒蛋白,这一过程较为缓慢,这是由于果胶与Ca2+形成的聚合物在模拟胃酸的酸性(pH=2.0)条件下较为稳定,微凝胶表面不易破裂,有效的保护了包裹在内部的硒蛋白;进入模拟肠液后,硒蛋白迅速释放,在肠液消化9 h后,释放已经接近饱和,此时的释放量高达73.6%,这是由于果胶与Ca2+形成的微凝胶在模拟肠液(pH=6.8)中发生膨胀,表面破裂,无法有效保护内部包埋的硒蛋白。释放实验结果表明,果胶凝胶包埋后的硒蛋白在进入生物体后,在模拟胃液中的状态较为稳定,进入肠液后,释放速度和释放量远远大于在模拟胃液中,说明采用果胶为壁材包埋硒蛋白制备的微凝胶确实具有肠溶性,使得硒蛋白减少了在胃中胃液的破环。以上研究技术有望实现硒蛋白缓释、靶向输送以及提供高生物利用度,可用于开发富硒食品。

图8 负载硒蛋白果胶微凝胶在模拟胃肠液中连续释放曲线

3 结论

为了改善植物硒蛋白有特殊气味,同时减少硒蛋白在胃部功能成分的破坏,实现其缓释、靶向输送以研制富硒功能食品。本研究以柑橘果胶为微胶囊壁材,利用凝聚特性构建负载硒蛋白果胶微凝胶。具体研究结论如下:在单因素的基础上结合正交试验得到负载硒蛋白果胶微凝胶最佳工艺条件:果胶浓度5.0%(w/v)、CaCl2浓度为2.0%(w/v)、包埋操作温度30 ℃。在此条件下硒蛋白包埋率为66.3%±1.64%,并经原子荧光光谱法测定载硒量为(308±8.71) μg/g。经过果胶微凝胶包埋后,硒蛋白的特殊气味得到了有效掩盖;通过SEM结果可以直观观察到硒蛋白被完整有效的包裹在果胶微凝胶中,而FTIR和TGA测试分别从分子结构和热失重曲线变化上验证了这一结果。此外,TGA分析还证实了硒蛋白被果胶微凝胶包埋后其热稳定性得到了明显的提高;模拟体外消化实验表明:在胃液2 h体系中硒蛋白的累计释放量仅为6.1%,而模拟肠液消化9 h后累计释放达73.6%,说明在微凝胶化后可以增强硒蛋白的环境稳定性,有效减少其在胃液中的破坏,提高其在肠液中的缓释能力。

以上研究结论,为硒蛋白在富硒食品加工中的稳定性与生物利用研究提供了理论基础,同时提出了一种研制富有机硒食品的新途径。在后续工作中,将进一步对负载硒蛋白果胶微凝胶的体内生物利用度及功能性评价开展研究,推进其作为有效的有机硒源应用于富有机硒食品的开发。