基于CRISPR/Cas9 技术快速构建PRV gE 基因缺失病毒

（内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018）

伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）属于疱疹病毒科，会导致成年母猪流产、产死胎以及仔猪中枢神经系统疾病，未免疫母猪产下的仔猪感染PRV 时，死亡率可达100%[1-2]。早在1947 年，我国首次从患猫体内检测出PRV。1970 年后，PRV 在我国呈蔓延趋势，直至从匈牙利引入Bartha-K61 株疫苗后，疫情才得到有效控制[3]。2011 年以来，PRV 在我国发生变异，使Bartha-K61 疫苗不能提供足够的保护，导致伪狂犬病迅速流行，并席卷全国[4-7]，其中母猪患病率达35%以上，野毒感染猪群超过50%，对我国养猪业造成了巨大损失[8]。PRV 基因组编码许多蛋白，其中gE 蛋白是主要的毒力因子。在PRV 变异株感染的猪群中，检测发现gE基因抗体水平逐年上升。因此，gE基因缺失疫苗可以在降低病毒毒力的同时区分野毒感染和疫苗免疫[9]。我国最初引入的Bartha-K61 株就是gE基因缺失疫苗株。早在2000年，何启盖等[10]使用TK-/gG-/LacZ+突变株进行动物实验，证实PRV 基因缺失毒株的安全范围比亲本毒株广，具有很好的免疫原性。自2013 年以来，CRISPR/Cas9 技术作为强大的基因编辑技术[11]，已经在病毒基因编辑上获得了广泛应用，如：Van等[12]利用CRISPR/Cas9 技术成功编辑了HCMV和HSV-1；2018 年穆艳霞等[13]使用CRISPR/Cas9技术，利用先重组EGFP 标签反向筛选的方法成功获取了IBR-ΔgE病毒；汤艳东等[14]构建了萤光素酶标记基因、EGFP 基因双标签重组病毒，同时建立了PRV 大片段缺失平台，证实了2 个sgRNA介导的大片段基因缺失效率更高。因此，本研究基于CRISPR/Cas9 技术与实验室分离到的PRV 毒株，快速对其gE基因进行编辑，旨在为今后的PRV 基因编辑提供思路，也为后期应对PRV 变异株的基础研究及防控提供一种候选方法。……