超高效液相色谱-串联质谱法同时测定血液中115种农药

杜秋瑶，张云峰，王继芬，王 璐，常 靖，董林沛，吴小军，刘冰洁

(1.中国人民公安大学 侦查与刑事科学技术学院，北京 100038；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038；3.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191；4.爱博才思亚太应用支持中心，北京 100015)

在临床和法医毒理学领域，常需对血液、尿液、胃内容物和内脏器官等生物检材中的毒物进行筛查和定量，以寻找疾病或死亡的原因[1-3]。常见的毒物主要包括农药、杀鼠剂、金属毒物、挥发性毒物、临床药物、毒品、植物毒素、动物毒素、无机毒物9大类[4]。近年随着农业的发展，农药的种类日益增多，使用范围不断扩大。常见的农药主要包括有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、除草剂及其它水溶性农药[4]。农药的使用在提高农业生产效益的同时，也使各类有机污染物在环境和生物体内积累，对生态环境和人类健康构成了严重威胁。大量研究表明，农药暴露与某些慢性疾病的发生率升高之间存在联系，包括癌症、帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、糖尿病、心血管疾病、慢性肾脏病及不育症等[5]。慢性疾病的常见特征是细胞稳态的紊乱，它往往可以通过农药对离子通道或酶受体等的扰动而诱发[5]。此外，由于意外、自杀或故意犯罪而导致的急性农药中毒案例也时见报道[6]。目前对农药残留的高通量检验研究多集中在食品和环境样本，研究者们建立了高通量检测蔬菜、水果、茶叶、月柿、中药材等样本中农药残留的方法[7-11]。本文致力于建立人体血液中农药的高通量检验方法，为临床和法医毒理学中农药的快速检验提供技术支持。

检测血液样本中农药的常用方法有气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)，配置紫外(UV)或二极管阵列检测器(DAD)的高效液相色谱法(HPLC)以及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[12-13]。其中串联质谱技术因其高灵敏度、高专属性和高通量的优势，得到了广泛应用[14]。由于气相色谱在亲水性、热不稳定性和非挥发性农药中的适用性受限，更多检测以液相色谱-串联质谱技术为主[15]。本研究结合实际中毒案例，选取了常见的115种农药，包括59种有机磷类农药、19种拟除虫菊酯类农药、17种氨基甲酸酯类农药、17种除草剂，以及昆虫生长调节剂类杀虫剂噻嗪酮、人工合成的沙蚕毒素的类似物杀虫单、低毒性杀菌剂三唑酮(详见表1)。结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术进行分析研究，通过优化分析条件和提取净化方式，建立了同时测定血液中115种农药的方法。该方法简单高效，实现了一针进样同时对百种农药进行分析的目的，对临床和法医毒物检验工作具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

LC-30A HPLC仪器(日本Shimadzu公司)，配备两个LC-30A泵，SIL-30A自动进样器，CTO-30A恒温柱室和DGU-30A脱气机；具有Turbo VTM离子源的5500 QTRAP三重四极杆质谱系统(美国Sciex公司)；Milli-Q去离子水系统(法国Millipore公司)；DHC-16500台式高速离心机(澳洲Kewlab公司)；Vortex-Genie2可调速涡旋混合器(美国SI公司)；移液器和2 mL离心管(德国Eppendorf公司)。

115种农药标准品(纯度> 95%，德国Dr.Ehrenstorfer)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸、甲酸铵(HPLC级，美国Fisher Scientific)；空白血由首都医科大学附属复兴医院提供。

1.2 标准溶液的制备

用甲醇将质量浓度为10.0 μg/mL的混合标准品溶液稀释至2.0 μg/mL，制得标准储备溶液，将其在-20 ℃密封避光储存。使用时用甲醇将标准储备液稀释成1.0 μg/mL的标准中间溶液，再逐级稀释为200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 ng/mL的标准工作液，4 ℃下密封避光保存。精确配制1.0 mol/L的甲酸铵标准储备液，4 ℃下密封避光保存。

1.3 样品的前处理

准确移取200 μL样品于2 mL离心管中，加入1 000 μL甲醇作沉淀剂，涡旋振荡2 min，以12 000 r/min离心10 min，取上清液于配套液质进样瓶中，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 液相色谱条件

Kinetex Biphenyl色谱柱(100 mm × 3.0 mm，2.6 μm)，柱温40 ℃，进样量2 μL。流动相：A相为含5 mmol/L甲酸铵的水溶液；B相为含5 mmol/L甲酸铵的甲醇溶液；流速0.5 mL/min。梯度洗脱程序：0～0.5 min，3% B；0.5～1.1 min，3%～40% B；1.1～2.0 min，40%～60% B；2.0～7.0 min，60%～80% B；7.0～10.0 min，80%～83% B；10.0～10.1 min，83%～95% B；10.1～13.0 min，95%～98% B；13.0～15.5 min，98% B；15.5～15.6 min，98%～3% B；15.6～19.0 min，3% B。

1.5 质谱条件

离子源和扫描方式：电喷雾电离正离子模式(ESI+)和电喷雾电离负离子模式(ESI-)同时切换扫描；检测方式：Scheduled MRM；喷雾电压IS：5 500 V(ESI+)/-4 500 V(ESI-)；雾化气(GS1)：379 225 Pa，离子源温度(TEM)：550 ℃；气帘气(CUR)：241 325 Pa；辅助气(GS2)：341 750 Pa；碰撞气(CAD)：48 265 Pa；化合物的射入电压(EP)和碰撞室射出电压(CXP)，在正离子模式时为10 V和17 V，负离子模式时为-10 V和-17 V。经过优化的所有分析物的其他参数，包括定量与定性离子对、去簇电压(DP)及碰撞能量(CE)，见表1。仪器控制、数据采集和处理使用Analyst 1.6.3和SCIEX OS 1.5软件进行。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

查阅文献获知化合物的分子式，在电喷雾离子源正负离子模式下，先用针泵进样各目标化合物的单个标准溶液，使用Q1 Scan确定母离子的质荷比；使用Product Ion Scan设定CE初始值为5 eV，以5 eV为步长自动调节CE，得到至少2～3个响应值高的特征子离子的质荷比；根据选出的母、子离子，组建定量与定性MRM离子对，优化CE和DP，以得到的参数初步建立MRM方法[16]。优化结果见表1。

2.2 流动相的优化

图1 115种农药的提取离子流色谱图(10 ng/mL)Fig.1 Extracted ion chromatogram of 115 pesticides(10 ng/mL)

选用甲醇作为有机相B，比较了在有机相和水相中不加盐与同时加入2、5、10 mmol/L甲酸铵时，各目标化合物的峰值响应情况，结果表明，当流动相中加入5 mmol/L甲酸铵时，所有目标农药在灵敏度、峰形和分离度等方面的综合情况较好，故确定流动相中加入甲酸铵的浓度为5 mmol/L。考察了流动相在不加酸，以及加入体积比为0.01%、0.05%、0.1%甲酸的情况下，待测农药的峰值响应情况。结果表明，当流动相中不加酸时，各待测农药在灵敏度、峰形和分离度等方面的综合情况较好，因而最终选用含5 mmol/L甲酸铵的甲醇溶液-含5 mmol/L甲酸铵的水溶液体系作为流动相。以此流动相体系运行MRM方法，确定各待测农药的保留时间，建立Scheduled MRM方法，分时间窗口进行数据采集，以提高检测效率和灵敏度[17]。115种农药的提取离子流图如图1所示。

2.3 前处理方法的优化

提取各类基质中的农药常采用的前处理方法包括：沉淀蛋白法、液液萃取、固相萃取、分散固相微萃取、低共熔溶剂萃取以及QuEChERS前处理方法等[18-19]。本研究考虑到实际工作中快速高效的分析要求，考察了操作较为简便的固相萃取和有机溶剂沉淀蛋白前处理方法。固相萃取采用HLB固相萃取小柱，分别考察了甲醇和乙酸乙酯作为洗脱剂时的提取效果。结果表明，HLB固相萃取法提取血液中的目标农药效果较差，部分农药不能有效提取。沉淀蛋白法考察了甲醇和乙腈两种常用沉淀剂提取效果的差异，并研究了沉淀剂用量对回收率的影响[16]。在农药添加水平为10 ng/mL时，考察了样品与沉淀剂的体积比分别为1∶2、1∶3、1∶5、1∶10时的加标回收率，以空白基质匹配农药标准溶液做回收实验。结果表明，当样品与沉淀剂体积比为1∶2和1∶3时，乙腈的沉淀效果虽明显优于甲醇，但仍有部分目标农药的回收率未达到预期范围。当样品与沉淀剂的体积比为1∶5和1∶10时，两种沉淀剂的提取效果和回收率无明显差异，其中甲醇作为萃取溶剂，样品与沉淀剂体积比为1∶5时，目标农药的加标回收率较好(80%～110%)，且由于甲醇毒性较乙腈低，因而最终确定以甲醇作为沉淀剂，样品与沉淀剂体积比为1∶5的方法沉淀蛋白。

2.4 基质效应

用空白基质配制的标准溶液中目标农药的峰面积(A)与溶剂配制的标准溶液中目标农药峰面积(B)的比值来考察方法的基质效应(ME)，ME=A/B×100%。当ME<100%时，说明基质对目标物有抑制作用，当ME>100%时，则存在基质增强效应[20]。分别计算农药添加质量浓度为10、50、100 ng/mL时的基质效应。根据实验结果，所有目标农药的基质效应为81.8%～115%。定量分析时应考虑基质效应的影响，以确保方法的准确性和可靠性[21]。

2.5 线性关系、检出限与定量下限

在空白血液中分别添加0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的混合农药标准品，按照优化的实验条件进行测定，以目标物的质量浓度(x，ng/mL)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行线性回归。结果表明，115种农药在1～200 ng/mL范围内线性关系良好(r>0.99)，87%目标农药的检出限(LOD，S/N≥ 3)达到0.1 ng/mL，13%为0.2 ng/mL，115种农药的定量下限(LOQ，S/N≥ 10)均为1 ng/mL。说明该方法具有较高的灵敏度，可以满足农药残留测定的要求[22]。

2.6 回收率及日内、日间相对标准偏差

分别在10、50、100 ng/mL 3个浓度水平下对空白血液样品进行加标回收实验，每个浓度水平在1天内重复进样6次，计算相对标准偏差(RSD)，得到日内精密度(Intra-RSD)；连续进样3天，计算日间精密度(Inter-RSD)。相关数据显示，115种农药的回收率为80.4%～109%，日内精密度为1.6%～11%(见表1)，日间精密度为1.9%～13%。说明该方法的重复性和准确性良好，证明了其在多农药分析中的可靠性和实用性。

表1 115种农药的保留时间(RT)、质谱参数、回收率及相对标准偏差Table 1 Retention times(RT),MS parameters,recoveries and RSDs for 115 pesticides

(续表1)

(续表1)

2.7 实际案例应用

2019年9月,甘肃省某男子在家中用餐后中毒死亡，经调查其妻子在该名男子所喝菜汤中加入了农药，农药来自于一标有“氯氰菊酯”字样的塑料瓶，瓶内农药已被倒光。送检检材包括塑料瓶的甲醇提取液约5 mL,死者血液样品约3 mL。取10 μL塑料瓶提取液用甲醇逐级稀释1 000倍进行分析，检出高浓度的敌敌畏、毒死蜱和氯氰菊酯。取死者血液样品200 μL按照本研究所建立的方法进行分析，检出敌敌畏189.04 ng/mL，tR=4.93 min，定量离子对220.9/109.0(m/z)；毒死蜱171.32 ng/mL，tR=11.79 min，定量离子对349.9/197.9(m/z)；氯氰菊酯106.50 ng/mL，tR=12.73 min，定量离子对433.1/191.0(m/z)，其色谱图见图2。剩余检材进行密封避光冷冻保存。实验结果表明该方法可应用于实际案例的检测。

图2 3种农药的色谱图Fig.2 Chromatograms of three pesticides

3 结 论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定血液中115种农药的方法。该方法简便快速、灵敏度高、稳定性好，满足了实际工作中一针进样同时对百种农药进行定性定量分析的需求，为法医毒理学生物基质中多农药的检验鉴定提供了高效可靠的途径。