在线自由基清除法引导具有抗氧化活力蛋白组分分离纯化

张宏伟 ，郭 阳，孙义玄，包怡红*

（1.东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

在线自由基清除法是灵敏、高效且简单的检测抗氧化组分方法，通过分析色谱柱分离得到样品组分测定在线自由基清除能力，确定具有自由基清除能力的组分[1-2]。该方法应用于杜鹃花叶中黄酮类物质、火龙果中酚类抗氧化剂快速检测，咖啡加工过程中抗氧化物质变化和万寿菊花抗氧化成分分析等研究，从复杂天然物质中高效筛选具有抗氧化能力物质，并提高具有抗氧化活力蛋白分离纯化效率，解决传统分离纯化过程需要长时间确定并优化填料型号、填充高度和分离纯化条件等问题[3-4]。

松仁营养价值高，蛋白含量14%～20%，脂肪含量31%～68%[5-6]。不同来源松子成分差异较大，取决于亚种之间差异及地理、气候条件[7]。松仁富含油脂，保健功能良好、经济价值较高，可生产高附加值松仁油，但榨油副产物松仁粕未得到充分利用，造成松仁蛋白资源浪费。松仁蛋白具有抗氧化活力[8]，目前多数研究关注松仁中抗氧化肽和松仁蛋白水解后制备抗氧化肽[9-10]，而对具有抗氧化活力松仁蛋白研究较少。

本研究使用在线ABTS自由基清除法引导松仁粕中具有抗氧化活力蛋白组分分离纯化。采用阴离子交换层析分离纯化松仁粕水提物，运用在线ABTS 自由基清除法分析馏分，快速筛选具有抗氧化能力蛋白馏分，根据分析结果选择合适分离纯化填料、柱子和收集策略，分子筛纯化馏分，获得具有较强抗氧化活力松仁蛋白组分。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

低温压榨红松松仁粕，购自黑龙江省宏泰松仁有限责任公司，使用自封袋分装后于-18 ℃保存。松仁粕中粗蛋白含量33.5%，碳水化合物含量32.5%，粗脂肪含量9.2%。

石油醚（沸程30～60 ℃）、硫酸、苯酚、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、氯化钠、磷酸等试剂，均为分析纯，购自国药集团。

1.2 方法

1.2.1 松仁粕水溶性蛋白提取

采用高速匀浆水提取法提取脱脂松仁粕中水溶性蛋白。采用索氏抽提方法利用石油醚对松仁粕脱脂。在水温35 ℃条件下，按照液料比43.23 mL·g-1、20 000 r·min-1高速匀浆提取170 s，提取物在4 ℃条件下3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，滤纸过滤后得到松仁粕水溶性蛋白提取物。

1.2.2 阴离子交换分离

使用DEAE-Bestarose FF 填料对松仁粕水溶性蛋白提取物分离纯化。柱体积约130 mL，柱子内径2.6 cm，上样浓度10 mg·mL-1，上样量0.4 柱体积（CV），上样流速1 CV·h-1，洗脱流速3.5 CV·h-1，每1 min 收集1 管馏分。采用阶梯式梯度洗脱，A 相为蒸馏水，B 相为0.5 mol·L-1NaCl 溶液，0%B洗脱1 CV，20%B 洗脱1 CV，40%B 洗脱1 CV，60%B 洗脱1 CV，100%B 洗脱1 CV，0%B平衡1 CV[11]。使用280 nm 波长监测蛋白洗脱情况，电导率辅助监测洗脱液电导率变化。

1.2.3 馏分分析

考马氏亮蓝法测定蛋白含量[12]。硫酸苯酚法测定碳水化合物含量[13]。

1.2.4 同步测定各组分分子质量和ABTS自由基清除能力

具体方法基于Agilent 公司1100 液相色谱系统和自制反应环（聚四氟乙烯材质），系统配置如图1 所 示[3,14-15]。

采用分子排阻色谱法（SEC）测定样品中各组分分子质量分布，使用TOSOH 公司G2000PWxl 排阻色谱柱分离，流动相为0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液pH 6.8，流速1 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量100 μL。样品中蛋白浓度为1 mg·mL-1，过0.45 μm 纤维素膜后进样。吸取40 μL混合蛋白分子质量标准品溶于200 μL流动相中作为分子质量标准品。

ABTS 自由基溶液配配置：准确称取10.97 mg ABTS，加入1 L pH 7.4 磷酸盐缓冲液中（含8.00 g NaCl，1.40 g Na2HPO4，0.15 g KCl，0.27 g KH2PO4），加入2.00 g MnO2后于暗处室温搅拌反应10 min，生成绿色ABTS 自由基。1 000 g 离心5 min 后取上清过0.22 μm 尼龙滤膜，装入棕色瓶中冷藏待用，4 ℃条件下至少可稳定使用24 h。1 号紫外检测器流出液进入自制反应环，衍生温度35 ℃，ABTS自由基溶液泵入速度0.8 mL·min-1，使用2 号紫外检测器检测衍生系统流出液在414 nm 波长下色谱图。自制反应环体积0.5 mL，通过反应环液体流速为1.8 mL·min-1，造成延迟时间16.67 s。

1.2.5 分子筛分离纯化

使用Sephacryl S-100 HR 填料对阴离子交换提取物作分子排阻纯化。柱体积约80 mL，上样量5 mL，使用0.1 mol·L-1NaCl 溶液洗脱，流速2 mL·min-1，每2 min收集1管馏分[16]。使用280 nm波长监测蛋白洗脱情况。

1.2.6 ABTS自由基清除能力测定

参照Re 和Fellegrini 等方法[17-18]，按实际情况适当修改。使用20 mmol·L-1pH 4.5醋酸钠缓冲溶液配制7 mmol·L-1ABTS储备液，向ABTS 储备液加入终浓度2.45 mmol·L-1过硫酸钾，混合均匀后置于室温黑暗处反应12～16 h 制备ABTS 自由基储备溶液。使用前将ABTS自由基储备溶液20 mmol·L-1用pH 4.5 醋酸钠缓冲溶液稀释至734 nm 处吸光度为0.7±0.02。取3 mL 该溶液与100 μL 待测样品充分混合，避光反应6 min，以水为空白，在734 nm处测定吸光度值。按照公式（1）计算样品ABTS 自由基清除率。

1.2.7 铁离子还原能力测定

FRAP法参照Benzie等方法适当修改[19-20]，FRAP试剂需现用现配，由2.5 mL 10 mmol·L-1TPTZ，25 mL 0.3 mol·L-1pH 3.6 醋酸盐缓冲液和2.5 mL 20 mmol·L-1FeCl3溶液混合而成。以蒸馏水作空白，取100 μL样品加入3 mL FRAP试剂混合均匀，在37 ℃下反应5 min后于593 nm处测定吸光值，

以 浓 度 为800、600、400、200、100 和50 μmol·L-1FeSO4溶液为标准液替代样品，反应后绘制标准曲线。以FeSO4浓度为X 轴，以对应吸光度值为Y 轴，得到标准曲线：y=0.6455x+0.0947（R2=0.9992）。样品抗氧化活性（FRAP value）以达到同样吸光度值所需FeSO4毫摩尔数表示。FRAP 值越大，说明样品抗氧化性越强。

1.2.8 铁离子螯合能力测定

铁离子螯合法参照Wong 等方法适当修改[21]。取1 mL 20 μmol·L-1硫酸亚铁与1 mL 500 μmol·L-1Ferrozine 混合均匀后再加入0.5 mL 样品混合均匀，以蒸馏水作空白，于562 nm处测定吸光值，每个样3组平行试验，按公式（2）计算铁离子螯合能力。

式中，A-空白溶液吸光值；A1-反应后样品溶液吸光值。

2 结果与分析

2.1 阴离子交换分离纯化结果

由图2 可知，在0～0.5 mol·L-1NaCl 洗脱条件下，松仁粕水溶性蛋白提取物被分为8个大峰，水洗脱阶段，中性组分被洗脱形成1 号和2 号大峰；在20%B 洗脱阶段，被洗脱组分形成3 号和4 号大峰；在40% B 洗脱阶段，被洗脱组分形成5 号和6 号大峰；在60% B 洗脱阶段，被洗脱组分形成7 号峰；在100% B 洗脱阶段，被洗脱组分形成8号峰。

Zeta电位试验结果表明，松仁粕水溶性蛋白提取物电势为负值，说明松仁粕水溶性蛋白带负电荷，因此运用DEAE-Bestarose FF 填料作分离纯化。洗脱图谱表明，该填料可有效分离松仁粕水溶性蛋白提取物。

2.2 阴离子交换馏分组成分析结果

以1 管·min-1速率收集各馏分，测定每管馏分蛋白和碳水化合物，馏分分析见图3。可知，1 号峰和2号峰碳水化合物含量较高，随着洗脱液离子强度增大，洗脱下的峰中碳水化合物含量逐步降低，其中6、7 和8 号峰蛋白含量相对较高。可知松仁粕中水溶性蛋白组分主要存在于较高离子浓度洗脱馏分中，研究重点为3～8号峰。

2.3 各馏分分子质量分布和具有ABTS 自由基清除能力组分分析

根据2.2结果，将各峰蛋白浓度最大馏分分别命名为1～8 号馏分，分析其在线ABTS 自由基清除能力，结果如图4～7 所示。a 图谱为在线ABTS 自由基清除能力图谱，具有ABTS自由基清除能力物质在414 nm 波长检测图谱上出现负峰，负峰相对峰高或面积越大，代表ABTS自由基清除能力相对较强。b图谱为相应蛋白组分分子质量分布图谱。

如图4 所示，1 号馏分几乎无ABTS 自由基清除能力，因此不作进一步研究。2 号馏分在10～13 min ABTS自由基清除图谱中有3个具有ABTS自由基清除能力组分。第1个具有抗氧化活力组分峰时间10 min，其对应组分分子质量10 ku，该组分在280 nm 无紫外吸收，非蛋白或肽类，具体成分有待后续研究。11 min 后有2 个具有ABTS 自由基清除能力组分，由于本研究所用排阻色谱柱分离极限为5～300 ku，峰时间大于11 min物质在分离极限之外，因此仅通过其峰时间和具有280 nm紫外吸收判断这些物质是分子质量低于6 ku 含氨基酸或肽键物质，松仁水溶性蛋白中分子质量最小为松仁2S 清蛋白，分子质量为7 ku，因此这些组分可能为肽类。本研究分离纯化目标为蛋白，因此不作进一步研究。

如图5所示，3号馏分基本无ABTS自由基清除能力，因此不作后续研究。4 号馏分在6～11 min-ABTS自由基清除图谱中有2个相对较强具有ABTS自由基清除能力组分，第1个具有抗氧化活力组分峰时间在7 min，在280 nm 波长检测排阻色谱图中无对应峰，应不是蛋白或肽类，具体成分有待后续研究。第2 个具有抗氧化活力组分峰时间10.5 min，峰展较宽，280 nm波长检测排阻色谱图中对应两个峰，通过分子质量标准曲线计算可知，峰时间为9.98 min 组分其分子质量为14.7 ku，通过分子质量分析，为松仁2S 清蛋白二聚体；峰时间为10.76 min组分其分子质量为7.2 ku，通过分子质量分析，为松仁2S清蛋白。通过ABTS自由基清除峰高比较，松仁2S清蛋白ABTS自由基清除能力强于松仁2S清蛋白二聚体，对松仁2S清蛋白进一步分离纯化。

如图6所示，5号馏分基本无ABTS自由基清除能力，因此不作后续研究。6号馏分中存在2个具有相对较强ABTS 自由基清除能力蛋白组分。通过分子质量标准曲线计算可知，峰时间为5.89 min大峰，分子质量为203 ku，通过分子质量分析，为松仁7S球蛋白三聚体。峰时间为10.76 min小峰，分子质量为7.2 ku，通过分子质量分析，为松仁2S清蛋白。

在ABTS 自由基清除图谱中，峰时间6 min 清除峰峰展较大，因多个分子质量相近组分所致，但280 nm 紫外图谱对应位置仅1 个峰。因此，在其后还存在具有ABTS 自由基清除能力未知组分。在使用分子筛制备该组分时，为提高纯化产物蛋白含量和纯度，仅收集峰前半部分，峰后半部分可用于下次分子筛纯化。后面峰时间为10.76 和11.24 min 组分分子质量相近，峰时间为10.76 min组分为松仁2S 清蛋白，为目标组分，11.24 min峰组分分子质量低于本研究所用排阻色谱柱分离范围，为分子质量低于6 ku 小肽。由于本研究主要纯化具有抗氧化活力蛋白，需重点考虑如何分离分子质量7.2 ku 松仁2S 清蛋白与分子质量低于6 ku 小肽。常用Superdex 75 填料分离范围3～70 ku，Sephacryl S-100 HR 填料分离范围1～100 ku，Sephacryl S-200 HR 填料分离范围5～250 ku，为兼顾松仁7S球蛋白三聚体和松仁2S清蛋白分离，选择Sephacryl S-100 HR填料用于后续分离纯化。

分子质量为7.2 ku 松仁2S 清蛋白和分子质量低于6 ku 小肽分子质量相差较小，需较多分离塔板才能有效分离，在分离填料粒径一定条件下仅依靠较长分离距离保证较多分离塔板数。本研究使用直径为16 mm XK16/60 柱装入Sephacryl S-100 HR填料分子筛纯化，高径比设定为25∶1。由于松仁2S 清蛋白和分子质量低于6 ku 小肽分子质量相差较小，为提高纯化产物蛋白含量和纯度，仅收集峰前半部分。

如图7所示，7和8号馏分具有相对较弱ABTS自由基清除能力。7号馏分有2个具有一定ABTS 自由基清除能力组分，但280 nm 紫外检测图谱上无对应峰，因此不作后续研究。8号馏分有2个具有一定ABTS自由基清除能力组分，ABTS自由基清除图谱中峰时间12 min ABTS 自由基清除峰有对应具有280 nm 紫外吸收组分，由于该组分ABTS 自由基清除能力较弱，且可能为肽类（分子质量低于5 ku），因此不作后续研究。综上，2、4和6号馏分中存在具有较强ABTS自由基清除能力组分，由于2 号馏分中具有较强ABTS 自由基清除能力组分为肽类和未知组分，非蛋白组分，因此不对2号馏分作下一步纯化研究。4 号馏分中具有较强ABTS 自由基清除能力蛋白组分为松仁2S 清蛋白和松仁2S清蛋白二聚体，且松仁2S清蛋白ABTS自由基清除能力强于松仁2S清蛋白二聚体，因此松仁2S清蛋白为分离纯化目标物质。6号馏分中含有松仁7S球蛋白三聚体和松仁2S 清蛋白，对该组分进一步纯化可获得松仁7S 球蛋白三聚体和松仁2S 清蛋白，选择6号馏分进一步纯化。

2.4 分子筛分离纯化结果分析

将6号馏分冻干后，配置成蛋白浓度5 mg·mL-1样品液，每次上样125 mg蛋白，按照2.3中确定分离纯化方法，使用Sephacryl S-100 HR分子筛填料分离纯化，结果如图8所示。

6号馏分纯化色谱图中现3个峰，将1.3 CV洗脱峰命名为6#1p，将3 CV 洗脱峰命名为6#2p，使用标准曲线对2个峰作分子质量分析，6#1p分子质量约为189 ku，为松仁7S球蛋白三聚体，6#2p组分分子质量为8.1 ku，为松仁2S清蛋白。4.4 CV洗脱峰峰面积相对较小，且分子质量低于标准曲线范围，无法准确确定其分子质量，分子质量应低于6 ku，为肽类，因此不作进一步研究。

2.5 分子筛分离纯化获得蛋白组分分析

将得到收集液透析处理3次后冻干，6#1p中蛋白含量为86.2%, 6#2p 中蛋白含量为84.5%。将两种蛋白分别配置成蛋白含量为1 mg·mL-1溶液后作排阻色谱分析。

图9a 为6#1p 样品排阻色谱图，由图可知分子筛分离纯化效果良好，主峰占总峰面积99.5%，可认为获得具有单一组分松仁7S 球蛋白三聚体。图9b 为6#2p 样品排阻色谱图，由图可知分子筛分离纯化效果较好，虽含其他蛋白组分，但是主峰占总峰面积96.5%，可认为获得较纯净松仁2S清蛋白。

将松仁粕水溶性蛋白提取物、松仁7S 球蛋白三聚体和松仁2S 清蛋白分别配置成蛋白含量1 mg·mL-1溶液，测定抗氧化能力，测定结果列于表1。

结果表明，分离纯化得到松仁7S 球蛋白三聚体和松仁2S 清蛋白均具有一定抗氧化活力，且松仁7S 球蛋白三聚体抗氧化活性强于松仁2S 清蛋白。分离纯化得到两种蛋白ABTS自由基清除率和铁离子还原能力均低于原始松仁粕水溶性蛋白提取物，除提取过程中损失活力外，松仁粕中还具有抗氧化活力非蛋白组分，导致纯化后蛋白组分较原始松仁粕水溶性蛋白提取物抗氧化活力降低。

表1 抗氧化活力测定结果Table 1 Results of antioxidant activity determination

3 讨论与结论

3.1 抗氧化能力测定方法选择

测定抗氧化能力方法较多，但用于在线测定抗氧化能力方法较少，在线测定抗氧化能力要求反应速度快、灵敏度高、耐受盐和有机相影响[3,20]。这些方法中DPPH 自由基清除法和ABTS 自由基清除法比较适合在线测定抗氧化能力[2-3]。

DPPH自由基清除法反应速率较快，特别适合高有机相环境，反应几乎不受盐离子影响，可使用梯度洗脱方法分析，但无法在有机相浓度低于20%体系中稳定反应，使用范围受限[3]。ABTS 自由基清除法反应速率高于DPPH自由基清除法、可在纯水、pH 3～7 盐溶液和纯有机溶剂环境中反应，可使用梯度洗脱方法分析，但蛋白在高浓度有机相中不稳定，因此选择ABTS自由基清除法为测试方法[2]。

ABTS 自由基在414 nm 吸收强度高于734 nm吸收强度，为排除干扰传统测试方法常用734 nm测定ABTS 自由基清除能力[22-23]。本研究采用色谱柱分离组分，有助于减少干扰。为提高反应灵敏度，本研究选择414 nm波长检测。

3.2 在线自由基清除法引导与传统分离纯化方法比较

分离纯化是天然物质利用一种常见手段。经典分离纯化通常使用离子交换层析初步纯化获得馏分，采用各种试剂盒或者经典分析方法对馏分分析，发现功能性馏分后，再对该馏分进一步分离纯化。由于天然物质成分复杂，传统方法难以有效辨别馏分中具有活性具体组分，仅依靠经验设计后续试验方法或通过反复试验方法验证和调整，影响后续分离纯化效率。

本研究中，2、4和6号馏分中均含有具有较强ABTS 自由基清除能力组分，如果采用传统抗氧化分析方法，需对2、4 和6 号馏分进一步精细纯化分析。2 号馏分中具有ABTS 自由基清除能力组分为肽类和未知成分，并非本研究纯化对象，如按照传统方法测定抗氧化活力后开展后续纯化研究，通过分离纯化仅能得到肽类，由于无法收集具有抗氧化活力的未知组分，带来纯化产物抗氧化活力的较大损失，这种活力损失原因可能需反复试验才能找到，影响研究效率。

4 号馏分中具有ABTS 自由基清除能力组分为松仁2S清蛋白和松仁2S清蛋白二聚体，其中松仁2S清蛋白ABTS自由基清除能力更强，是下一步纯化目标，但在6 号馏分中也含有较多松仁2S清蛋白，从分离效率考虑不对4号馏分作后续纯化。如按照传统方法后续纯化，通过尝试不同分离范围填料获得较纯松仁2S 清蛋白，但在6 号馏分完成后续纯化研究后发现，4号馏分研究应用价值有限。

6 号馏分中具有ABTS 自由基清除能力组分为松仁7S 球蛋白三聚体和松仁2S 清蛋白。通过ABTS 自由基清除图谱分析，6 号馏分中含有松仁7S 球蛋白三聚体分子质量相近未知组分，松仁2S清蛋白与附近小肽分子质量较为接近，在后续纯化过程中需考虑这2个干扰因素。如按照传统方法后续纯化研究，为获得较高纯度松仁7S 球蛋白三聚体和松仁2S 清蛋白，可能需探索填料种类、分离柱长度和收集位置等因素。

综上所述，本研究以松仁粕水溶性蛋白中具有抗氧化活力蛋白组分分离纯化过程为例，应用排阻色谱结合在线ABTS自由基清除法直接获得目标组分ABTS自由基清除能力、分子质量和目标产物周围杂质信息，依据该信息设计后续分离纯化方法，最终获得具有较强抗氧化活力松仁7S 球蛋白三聚体（纯度99.5%）和松仁2S 清蛋白（纯度96.5%）组分。将以往最短5～10 d 分离纯化探索时间缩短为2～3 d，提高研究效率。排阻色谱结合在线ABTS自由基清除能力测定法可有效引导具有抗氧化活力蛋白组分分离纯化过程，提高后续精细分离纯化效率。