猪场生物安全疾病检测方法探讨

吕莫然，刘 爵

（1.北京农学院，北京 昌平 102206；2.北京农林科学院，北京 海淀 100097）

随着非洲猪瘟的暴发和生物技术的不断发展，养殖业的生物安全问题愈发突出。养殖场在建设时，要特别注意所选的建设场地，规划好合理的猪场结构和布局，完善配套的设施设备并注意及时改进，要有合理的生物安全体系，工作人员也要严格执行生物安全制度，进出猪场要严格消毒，对病猪死猪的处理也要按国家相关规定，进行无害化处理[1]。生物安全按方法实施的对象，可以分为外部防御和内部控制。外部生物安全防御主要是对养殖场的外来病原体进行控制，防止其进入，主要措施是加强外来人员的清洗消毒；内部生物安全是对养殖场内的病原体进行控制，防止其在养殖场内传播[2]。因此，及时发现养殖场内的病原体对内部生物安全的管理具有重要作用。目前实验室最常用的检测方法是PCR检测，此项研究通过实际操作实验中对临床样本流行性疾病猪圆环病毒3型的检测以及检测方法的优化来建立和完善生物安全体系进行建议指导。

1 材料与方法

1.1 材料

所用毒株以及临床样品均保存在实验室；病毒基因组DNA提取试剂盒购自Qiagen生物技术公司；PCR反应试剂购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒和临床样品的DNA提取

实验前先将水浴锅预热至56℃，缓冲液AL和ATL如果有沉淀要重新溶解，分别在缓冲液AW1和AW2中加入适量96%～100%的无水乙醇使之达到工作浓度。将样品粉碎在2 ml离心管中使用200 µl的PBS涡旋混合，加入20 µl的蛋白酶K，振荡混匀。混合200 µl AL缓冲液，震荡混匀之后放入预先加热好的56 ℃ 水浴锅中，温水浴10 min。向离心管中加入200 µl无水乙醇，振荡混匀。将上述液体用移液枪转移到DNeasy mini滤柱中，静止1 min，至少8 000hg离心大约1 min，弃去滤出液。将滤柱重新放入新的2 ml离心管，加入500 µl的缓冲液AW1混匀，8 000hg离心 1 min，弃去滤出液。将滤柱置于新的2 ml离心管，加入 500 µl的缓冲液AW2混匀，静止1 min，至少20 000hg离心大约3 min，弃去滤出液。将滤柱重新放入新的 2 ml离心管或1.5 ml离心管，在滤柱中间加入200 µl核酸酶的水，室温静置一会儿，6 000hg离心2 min。

1.2.2 引物的设计与合成

根据PCV 3全序列（MF155643.1），借助生物工具软件Primier 5在引物设计原则的基础上，设计两种进行普通PCR的特异性引物并送公司进行合成。其序列为：

P1：5ÿ -GTTACCCAACTGTG CCCATCTATG-3’；

P2：5ÿ -GTCACGCACAATTT CTCTCTCGG-3’。

1.2.3 实验室临床样品的检测

根据优化后的检测方法，对实验室临床样品进行检测，此过程根据试剂盒提供的说明书进行实验操作，PCR扩增检测实验采用25 µL反应体系，加入PCR mix 2.5 µL，forward primer(10 mmol/L) 12.5 µL，reverse primer(10 mmol/l) 0.1 µL，DNA 模板 0.1 µL，ddH2O 添加至25 µL。通过1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增反应产物。电泳缓冲液为1xTAE，电压为220 V，反应时间为10 min。使用紫外线照相仪对结果进行记录。

2 结果

2.1 PCV3 PCR反应条件优化结果

经过对扩增各参数多次的优化，对实验设计的引物进行特异性检测，结果如图1所示，只有特定检测的病毒有条带，表明病原体检测的方法具有高度特异性。

M：DL 2000 Maker；1：猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）2：猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）3：猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）4：猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）5：猪流行腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）6：猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）7：猪 瘟 病 毒（Classical swine fever virus，CSFV）8：猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）9：猪圆环病毒1型（Porcine circovirus type 1，PCV1）

2.2 临床病料检测的结果

利用优化好的聚合酶链式反应（PCR）检测方法，将实验室2018年之前和2019年在各省猪场收集的病料进行检测。样本包括心、肝、脾、肺、肾等脏器和支气管淋巴结、肠系淋巴结、腹股沟淋巴结、肺淋巴结等。检测结果可以反映猪场内部生物安全的管理效果，如表1所示。

3 讨论

近年来，随着流行性疾病的频繁暴发，猪场生物安全的内部控制变得愈发重要。一些传染病由于没有及时被检测出来，在猪群中快速传播，给养猪业带来了巨大的经济损失。因此建立灵敏特异的检测方法对完善生物安全体系具有重要作用。

图1 设计引物的特异性实验

表1 临床病料的检测结果

此次用于指导生物安全生产的是猪圆环病毒的一种基因型，猪感染后会引起断奶后多系统衰竭综合征、肾病、皮肤及内脏的炎症反应。感染母猪难以受孕，流产率上升，还会生产出弱胎、死胎、畸形胎甚至木乃伊胎。猪圆环病毒3型常常与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等形成混合或继发感染，仅仅根据临床症状和病理变化难以做出正确的判断。而电镜观察最直接，也最常规，是将病猪的组织制成切片在电镜下观察，但这种方法步骤繁琐，需要大量的时间和精力。原位杂交技术检测是使用探针与组织、细胞或染色体上待测单链DNA或RNA形成专一的核酸杂交分子，再经特殊方法检测出来；但目前这种方法在国内应用于检测猪圆环病毒不多见，操作也较为复杂，特异性不高。新兴起的LAMP（环介导恒温扩增技术）是指在设计好引物之后，在恒温水浴锅内进行基因的扩增，花费时间短，也无需特殊实验仪器，灵敏度比PCR也高，但在实际操作中，容易被气溶胶污染产生假阳性。ELISA检测方法是利用抗原或抗体的相互作用与酶进行连接，再与底物作用[3-6]；该种方法特异性和敏感性都比较高，缺点是检测过程中需要精密仪器（酶标仪），除此之外，使用该方法检测的试剂盒价格较高。IFA（间接免疫荧光）和IPMA（免疫过氧化物酶单层细胞实验）两种检测方法相似，主要区别是最后的观察，IFA依靠荧光观察，IPMA依靠酶进行显色反应观察。两者都需要精密的仪器，而且，IFA实验结果存在非特异性染色。综合来说，实验室大多数检测操作复杂，花费时间较长，专业性要求较高。PCR（聚合酶链反应）因其操作简便成为实验室应用最广泛的检测方法，实验需要设计出特异性较高的引物，以碱基互补配对为原则，在模板和引物的指导下，通过DNA聚合酶扩增出新链。

在对猪场内部进行生物安全管理时，要严格执行消毒制度，加强管理；科学饲养，提高猪群免疫力，加强保健意识。及时对猪群进行疾病检测，减少病毒感染扩散[7]。