CYP2R1基因多态性与恩替卡韦抗病毒治疗乙型肝炎病毒e抗原血清学转换的相关性

李凤中 陈卫国 陈小林 (萍乡市人民医院 检验科，江西 萍乡 337000；肝病科)

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍为全世界重要的公共卫生问题，目前约超过 2.4 亿人是HBV表面抗原(HBsAg)携带者。在 HBV 入侵人体并造成感染后，病毒、环境及宿主因素均可在进展为肝硬化、肝代谢异常甚至肝癌的过程中起重要作用〔1〕。近年来，宿主的基因多态性及免疫应答成为探索 HBV 感染后不同结局的热点〔2〕。体内研究也证明，1，25二羟基维生素D〔1,25(OH)2D〕可增强宿主抵抗病毒的能力〔3〕。将维生素 D 及其类似物与抗病毒治疗手段结合应用时，可显著提高机体的免疫应答率，从而为抗病毒治疗提供新的思路。CYP2R1基因位于染色体11p15.2上，含有5个外显子，编码维生素D25-羟化酶〔4〕。研究表明CYP2R1基因的单核苷酸的多态性(SNP)与人体内25(OH)2D水平显著相关，位于该基因第2外显子上的一个错义突变可能会引起体内维生素D缺乏现象，并最终影响维生素D生物学效能的发挥，增加2型糖尿病(T2DM)的患病风险〔5〕。但是有关CYP2R1 多态性与HBV感染及对乙型病毒肝炎(CHB)抗病毒治疗的关系研究还未见报道，因此有关 CYP2R1基因多态性与抗病毒治疗CHB疗效作用还需进一步研究。本研究选择CYP2R1基因两个 SNP位点作为候选位点进行基因分型分析，检测其CYP2R1基因多态性及抗病毒治疗疗效进行研究。

1 材料与方法

1.1病例选择 选取2016年6月至2017年12月萍乡市人民医院肝病门诊及住院的CHB患者65例为研究对象，男38例，女27例，平均年龄(62.1±4.03)岁。纳入标准：HBsAg呈阳性且已持续6个月以上；HBV DNA水平>1×105拷贝/ml；乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性；乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)为阴性。排除标准：患有人免疫缺陷病毒(HIV)和丁型肝炎病毒(HDV)及丙型肝炎病毒(HCV)感染；有肝癌或肝癌病史,甲胎蛋白(AFP)>50 ng/ml;以往接受过核苷酸或核苷酸类药物治疗；既往5年内发生过其他系统肿瘤病史。

1.2治疗方法 符合本研究入选标准的患者进行抗病毒治疗，给予常规恩替卡韦治疗，口服0.5 mg/d(南京正大天晴制药有限公司，国药准字H20120038)，治疗48 w。患者临床数据使用标准案例记录表格收集。

1.3乙肝病毒学治疗应答定义 在连续给予恩替卡韦治疗48 w后，HBV DNA小于500拷贝/ml，持续维持HBV DNA低水平至随访结束的72 w，同时患者血清HBeAg由阳性转为阴性，HBeAb为阳性且丙氨酸氨基转移酶(ALT)值正常范围内称为完全应答(CR)，反之没有发生血清HBeAg转变，称为非完全应答(NCR)。

1.4研究方法 给予CHB患者恩替卡韦治疗后，分别在12、24、48、72 w进行病例随访，并完成下列指标的检测：临床生化指标：天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、ALT、 总胆红素(TBiL)、总蛋白(TP)及白蛋白(ALB)，使用AU5400生化仪检测(贝克曼公司)。HBV DNA检测：HBV DNA指标的检测由医院PCR室按常规实验室方法进行，引物及相关步骤方法均按照中山大学达安基因 (PCR-荧光探针法)检测，严格遵照试剂盒说明书，货号DA0031。CHB患者CYP2R1 rs2060793，rs12794714 基因分型检测：人外周血全基因组DNA提取应用QIAGEN试剂盒，根据试剂盒的操作步骤，采用PCR方法来扩增目的基因。引物序列和PCR条件见表1。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行t及χ2检验。

表1 引物序列及反应条件

2 结 果

2.1两组临床特征比较 65例CHB患者在经过恩替卡韦抗病毒治疗后，显示CR为30例(CR组)，NCR为35例(NCR组)。两组性别、治疗前HBV DNA含量、AST及ALT水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

组别n男/女(n)年龄(岁)HBV DNA(log 10拷贝/ml)AST(U/L)ALT(U/L)CR组3018/1262.09±4.126.01±0.5334.59±3.3278.12±8.63NCR组3520/1562.55±2.975.95±0.4836.78±4.5280.74±7.71χ2或t/P值2.684/0.1020.852/0.2030.209/0.7040.642/0.4520.954/0.195

2.2CYP2R1基因SNP位点等位频率及Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验 在对CHB患者进行基因分型后，分析CYP2R1各个位点的等位频率，CYP2R1 rs2060793(-89T/T)和rs12794714 (-65T/C)次要等位基因频率分别为36.20%和16.70%，基因型频率的观测值和H-W预期值之间差异无统计学意义(χ2=2.516,P=0.125;χ2=2.049,P=0.107)，表明本研究中所选群体研究对象有代表性，达到遗传平衡定律。

2.3CYP2R1 rs2060793 和rs12794714 SNP位点基因分型与抗病毒治疗后HBeAg血清学转换关联分析 CR组rs12794714位点T等位基因频率明显高于NCR组，差异有统计学意义(χ2=4.07,P=0.035)。与C等位基因相比，T等位基因发生血清HbeAg转换的比值比OR为2.019(0.982～4.319)。TT和TC合并分析发现，携带TT基因型的患者在经过恩替卡韦治疗后，更容易实现血清转换，抗病毒应答效果更明显。而对于CYP2R1 rs 2060793位点，T等位基因频率在两组分布与TT基因型在两组分布频率差异均无统计学意义(P>0.05)。 见表3。

2.4CYP2R1 rs12794714基因型与恩替卡韦治疗后CHB患者HBV DNA含量关联分析 携带CYP2R1 rs12794714 TT基因型的患者在恩替卡韦在用药后第12 w、24 w、48 w及72 w随访HBV DNA含量低于非TT基因型的患者，其中第24、48、72周两组差异有统计意义(P<0.05)，见表4。

表3 CYP2R1 SNP位点分型与血清学HBeAg转换的关联性分析 (n)

基因型n治疗前第12周第24周第48周第72周非TT型246.09±0.855.59±0.604.08±0.423.39±0.333.09±0.25TT型415.85±0.785.05±0.463.04±0.302.10±0.272.01±0.18t值1.3251.9852.6043.2683.351P值0.1030.0980.0360.0150.014

3 讨 论

HBV入侵机体后，造成肝脏组织慢性炎症感染，病毒因素、环境因素及宿主本身因素均在此过程中起重要作用〔6〕。目前关于患者维生素D含量减少对许多慢性肝病病情发生的影响已经有报道〔7〕。研究发现补充维生素D与抗病毒治疗手段联合应用时，可显著提高CHB机体的免疫应答率，说明维生素D在抗乙肝病毒治疗中有着重要的功能〔8〕。机体25(OH)D3的含量与其代谢酶的关系密切，25(OH)D3由维生素D3前体在肝细胞内经25-羟化作用合成，主要由CYP2R1酶催化〔9〕。研究表明CYP2R1基因的SNP与人体内25(OH)D水平显著相关，位于该基因第2外显子上的一个错义突变可能会引起体内维生素D缺乏现象，并最终影响维生素D生物学效能的发挥，增加T2DM的患病风险〔10〕。Barooah等〔11〕发现CYP2R1基因rs10741657位点变异与人体内25羟基维生素D3水平显著相关，GG基因型携带者体内25羟基维生素D3水平是AA基因型携带者的1/2〔3〕。

CHB患者在临床治疗中要获得较好的疗效，一般要经历3个过程：HBV DNA的病毒载量水平较低；HBeAg发生血清学转换；实现血清学转换〔12〕。CR患者血清学转换成功说明宿主的主动免疫功能恢复。本研究结果说明CYP2R1基因多态性在恩替卡韦治疗后病毒学应答有相关联，TT型可以预测CHB患者在使用恩替卡韦的治疗效果。一些研究已提出通过检测宿主维生素D相关基因来预测对恩替卡韦治疗的反应〔13〕。最近研究表明CHB患者低血清维生素D水平与高水平的HBV复制和不良临床结果相关，包括肝硬化并发症及肝癌〔14〕。CYP2R1 rs12794714 TT基因型可预测恩替卡韦治疗后持续的HBeAg血清转换。本文结果与Zhang等〔15〕研究结论一致，该研究发现CYP2R1的rs12794714 SNP与中国东北地区儿童的血清25(OH)D3显著相关。

总之，CYP2R1 rs12794714基因多态性与CHB患者的HBV复制有关，可预测HBeAg阳性CHB患者对恩替卡韦治疗的抗病毒应答效果。但是本研究有局限性，如没有评估基线血清25(OH)D3水平的影响，因为它受到几个潜在的混杂变量影响，包括暴露于紫外线阳光，吸收不良，维生素的膳食摄入减少等原因。