闪式辅助超声提取长白落叶松中二氢槲皮素的工艺研究

霍云博，王露瑶，刘怡辰，吕 萍

(吉林农业科技学院食品工程学院，吉林 吉林 132101)

长白落叶松(LarixolgensisHenry、KoreanLarch)别名黄花落叶松、黄花松、朝鲜落叶松长白。从长白落叶松中提取出的二氢槲皮素又叫花旗松素、紫杉叶素、双氢栎精。二氢槲皮素是药用植物中重要的二氢黄酮醇类化合物，属于维生素PP族[1]。研究表明，二氢槲皮素具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗心血管系统疾病等生物活性，在医药、食品、保健产品、烟草等行业有着广泛的应用[1]。

闪式提取法是一种新型的提取方法，它利用植物组织破碎原理，使有效成分能够从植物体内大量溶解，快速、简便、无须加热，可以节省大量的时间、精力和能源， 能够在数秒钟内完成提取过程。本实验将闪式提取和超声提取相结合，极有可能达到节能、高效、时间短和高提取率的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长白落叶松松针采摘于吉林农业科技学院校园内，置于电热恒温干燥箱80℃常压干燥至恒重，粉碎至80目筛，装入磨口玻璃瓶备用。

实验试剂：二氢槲皮素标品(实验室自制)；硫酸、乙醇、乙酸、甲醇、蒸馏水(自制)、氢氧化钠、无水乙醇、石油醚、乙醚、氯仿，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

实验仪器：恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司生产)；500 g多功能粉碎机XS-10(上海兆申科技有限公司生产)；数控超声波清洗器KQ3200DB(昆山市超声仪器有限公司生产)；紫外可见分光光度计UV-2800AH(尤尼柯上海仪器有限公司生产)或V-1100D可见分光光度计 (上海美谱达仪器有限公司生产)；YRE-2000A旋转蒸发器或旋转蒸发仪RE-52A(上海亚荣盛华仪器厂生产)等。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线绘制

准确称取标准二氢槲皮素50 mg溶于乙醇中，定容100 mL，制备成0.5 mg/mL的对照液。取对照液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL移入25 mL容量瓶中，加入乙醇，使乙醇的体积达到3 mL/25 mL，加水定容。于300 nm处测定其吸光度[2]，用吸光度Y对二氢槲皮素浓度X(mg/mL)绘制标准曲线。

1.3.2 二氢槲皮素提取及精制

提取工艺： 长白落叶松松针→干燥→粉碎→称取松针粉末50 g→加入提取剂→闪式提取→收集提取液→超声波处理→收集上清液→抽滤→减压干燥→二氢槲皮素粗品→精制→高纯度二氢槲皮素。

精制流程：二氢槲皮素粗品→热水溶解残渣→冰箱冷冻结晶→快速离心→干燥

将减压浓缩至干的二氢槲皮素粗品，用热水溶解残渣，冰箱冷冻(5℃)结晶后快速离心，分离得到二氢槲皮素[3，4]。

计算：二氢槲皮素得率(mg/g)=aV/m×100%

式中：

a，提取液中二氢槲皮素浓度(mg/mL)；V，提取液的体积(mL)；m，样品质量(g)。

1.3.3 二氢槲皮素的定性检验

三氯化铝显色法：取上清液和对照液各2 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 1%的三氯化铝-乙醇溶液，然后加入乙醇，使乙醇的总体积达到3 mL/25 mL，加水定容至25 mL，在波长200～600 nm范围进行全波长扫描，两者在300 nm处均有较强的吸收，其紫外可见光谱如图1所示。

图1 二氢槲皮素和样品与三氯化铝络合后的紫外可见光谱图Fig.1 UV-visible spectrum of complexed dihydroquercetin and sample with aluminum trichloride

1.3.4 提取剂的选择

将长白落叶松、松树、松枝粉末准确称取3份，每份5 g。将3份样品分别放入三角瓶中，并分别加入20 mL乙醇、乙酸和蒸馏水进行闪式提取后合并提取液，再进行超声波提取合并提取液的上清液。将提取液进行抽滤干燥，算出提取率，选用提取率最高的溶剂作为提取剂。通过单因素实验得出，最佳提取剂选择为乙醇。

1.4 实验设计

在单因素实验数据基础上， 利用Box-Behnken对实验因素和水平进行设计，采用软件Design Expert 8.0.6进行设计。最终根据响应曲面法来确定各相关因素之间的交互作用及影响长白落叶松松针中二氢槲皮素提取率的程度，筛选出优化工艺的条件[5]。

2 结果与分析

2.1 长白落叶松松针中二氢槲皮素标准曲线的绘制

从计算结果来看, 二氢槲皮素浓度与吸光度线性关系R2为0.999 9，线性关系良好，回归方程为y=51.786x-0.013，详见图2。

图2 二氢槲皮素标准曲线Fig.2 Standard curve of dihydroquercetin

2.2 响应面法实验

2.2.1 响应面法实验结果

在单因素实验的基础上，进行4因素3水平响应面分析实验，如表1所示， 数据方差分析结果如表2所示。

表1 响应面法实验设计Tab.1 Experimental design of response surface method

2.2.2 响应面数学模型建立及其显著性检验

经过Design expert 8.0.6软件的计算和表2的结果可知，回归模型结果极其显著 (P<0.01)，建立的模型具有统计学意义，回归方程为：

表2 回归方程的方差分析Tab.2 ANOVA of regression equations

注：**代表极显著(P<0.01)、*代表显著(P<0.05)。

2.2.3 优化条件的模型验证

利用Design expert 8.0.6软件设计分析得出长白落叶松中二氢槲皮素最佳超声提取工艺条件，得到回归方程。考虑到实际操作的便利性以及更可靠的验证模型预测准确性，将条件设定为：闪式提取时间120 s、超声波功率190 w、液料比1∶10、超声提取时间32 min，并再次进行了相关验证，得到的实际平均二氢槲皮素提取率与之前计算的预测值间的相对偏差也是较为微小的，可以证明模型预测值与实际结果基本符合。

3 结论与讨论

传统的方法(回流法、浸渍法、微波萃取法等)操作简单，但提取时间较长，有时长达数周或者提取率较低。本研究方法采用闪式辅助超声提取法提取长白落叶松中二氢槲皮素，可加快提取速度，缩短提取时间，提高提取率。本研究利用响应面法优化长白落叶松中二氢槲皮素闪式辅助超声提取工艺参数，以长白落叶松中二氢槲皮素提取率为响应值，作为连续变量，应用软件Design Expert 8.0.6进行实验设计， 综合考虑提取温度、料液比、提取时间及其相互作用对二氢槲皮素提取率的影响，利用软件对数据拟合得二氢槲皮素提取回归方程，并对提取温度、料液比、提取时间进行方差分析，并利用该软件优化提取工艺参数，确定最佳提取剂为乙醇。结果表明，对二氢槲皮素提取率的影响因素大小顺序为液料比>超声提取时间>闪式提取时间>超声波功率，最佳提取工艺参数为闪式提取时间120 s、超声波功率190 w、液料比1∶10、超声提取时间32 min。在此条件下，二氢槲皮素提取率最高为0.48%。