骨炎消对KOA家兔滑膜组织病理学形态及炎性因子表达的影响

王 琳，王宝娟，郑曙光

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

膝骨性关节炎 (Knee Osteoarthritis，KOA) 是一种以膝关节软骨变性、缺损、软骨下骨质及关节边缘骨赘生成等为病理特征的慢性退行性疾病，常见于中老年人群。由于其发病机制多而复杂、病程长、易复发、不可逆性的特点，导致该疾病致残率极高，严重影响患者的身心健康和生活质量[1]。膝关节滑膜炎是一种以膝关节肿痛、积液、活动不便及功能受限为主要临床症状的骨伤科常见疾病，由慢性劳损或急慢性创伤造成滑膜细胞增多、血管生成和炎性细胞浸润等病理改变，并由此而发的非感染性炎症[2]。随着科学的进步，针对膝骨性关节炎发病机制的研究，人们不再局限于对关节软骨和软骨细胞病理改变的关注上，而是逐步明确滑膜炎症与邻近软骨之间的关系，以及在膝骨性关节炎发生发展的始末中所充当的重要角色。滑膜组织中分布着一些游离神经，且作用于这些游离神经中的神经因子和蛋白的高表达被认为与膝骨性关节炎症状的产生与变化有关[3]。研究发现，滑膜炎症产生的促炎介质可打破软骨基质合成与降解间的平衡，改变关节软骨的结构，再加上过多产生的蛋白水解酶的理化作用，使膝关节的退变进程加快，反向而论，软骨的改变也会加剧滑膜炎症，造成恶性循环[4]。中医针对KOA的治疗，方式多样、疗效显著，并在预防和缓解临床症状、减轻患者痛苦、提高生活质量方面优于西药，且毒副作用较小[5]。本研究通过对KOA家兔模型治疗前后滑膜组织的各项指标表达的分析，探讨苗医熏蒸验方对膝关节滑膜炎的治疗效果，以及对膝骨性关节炎发展进程的延缓作用。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

取50只体质量为(2.0±0.2)kg的成年健康新西兰大白兔，雌雄各半，由重庆腾鑫养殖公司提供，许可证号：SCXK(渝)2017-0010，标准清洁级动物房饲养，室温下给予复合饲料喂养。

1.2 药物与试剂

骨炎消是由黑骨藤、透骨香、大血藤、小血藤、飞龙掌血、蜘蛛香、淫羊藿等12味药材组成的苗药经验方，均购于贵州同济堂；苏木素伊红(HE)染色试剂盒，批号：C0105，购自碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，批号：CW0014S，购自康为世纪生物科技有限公司；蛋白上样Maker，批号：26625，购自Thermo生物有限公司；SDS-PAGE上样缓冲液，批号：BL502A，购自biosharp生物科技有限公司；碘乙酸钠，批号：305-53-3 BR，购自上海萌芽生物科技有限公司；β-Actin，批号：ab6040，购自abcom生物科技有限公司；PMSF(批号：R0010)、高效RIPA组织裂解液(批号：R0010)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(批号：P1200-2)均购自北京索莱宝生物科技有限公司；Rabbit Anti-TNF-α(批号：bs-33207M)、Rabbit Anti-NF-κB p65(批号：bs-0465R)、Rabbit Anti-P38 MAPK(批号：bs-0637R)、Rabbit Anti-IL-1β(批号：bs-0862R)均购自北京博奥森生物有限公司。

1.3 主要仪器

切片机，型号：RM2245，德国莱卡公司；高速冷冻离心机，型号：TGL20M，长沙迈佳森仪器设备有限公司；百乐凝胶图像分析仪，型号：ChemiDocTM Touch imaging systerm，成都百乐科技有限公司；水平电泳仪，型号：JY300，北京君意东方电泳设备有限公司。

2 方法

2.1 实验分组

将50只体质量为(2.0±0.2)kg的成年新西兰大白兔，雌雄各半，随机分为正常组、模型组、阳性组、早期苗熏组和苗药熏蒸组，每组各10只。根据王兴桂等[6]前期的实验数据显示，将苗药熏蒸组与清水熏蒸组进行对照治疗后，其结果表明二者是具有统计学差异的，故本实验不再增设清水熏蒸组作为对照治疗。

2.2 造模方法

先用生理盐水溶解碘乙酸钠，且按照7.5 mg/kg的比例配置成实验所需的不同浓度(根据家兔体重可得：将15 mg的碘乙酸钠粉末用0.2 mL的生理盐水溶解，所配置的碘乙酸钠溶液为建立KOA模型实验所需的最小浓度)。在无菌环境下把家兔置于解剖台上，仰卧位固定，左膝关节微屈，剪掉膝关节周围绒毛并进行消毒，用1 mL注射器由髌骨内侧下方斜上刺入关节腔，注入20%乌拉坦(4 mL/kg)进行麻醉，除去正常组不做任何处理外，其余4组各注射0.2 mL碘乙酸钠溶液，若进针后出现落空感，即为注射成功。

2.3 各组给药方法

正常组：清洁级动物房正常饲养，不做药物干预。模型组：造模后放置清洁级动物房正常饲养，不做药物干预。阳性组：造模成功(关节腔注射碘乙酸钠2周)后，膝关节上下各 4 cm范围给予扶他林软膏外用进行治疗，每天1次，1.2 g/次，连续6周。早期苗熏组：造模后的第一天便给予苗药熏蒸液做熏蒸治疗，30 min/d，每天1次，连续8周。苗药熏蒸组：造模成功(关节腔注射碘乙酸钠2周)后，给予苗药熏蒸液做熏蒸治疗，30 min/d，每天1次，治疗6周。

2.4 熏蒸方法

(1)首先在超声波雾化器装置中倒入苗药熏蒸浓缩液，温度调至60 ℃，将熏蒸治疗时的药液蒸汽温度控制在35～40 ℃；(2)为利于药液吸收，剪掉膝关节周围的兔毛，将充分暴露膝关节后的家兔仰卧位固定在兔解剖台上；(3)使用固定器把与超声波雾化器相连结的软管固定在家兔的膝关节位置，进行熏蒸治疗。

2.5 组织取材及处理

无菌环境下处死家兔，在髌骨上端用手术刀横切断各层组织，完全暴露膝关节腔，用镊子在髌骨下端与胫骨上端的交界处取出左后肢的滑膜组织，一部分置于4 ℃、4%的多聚甲醛中固定保存24 h，石蜡包埋、切片，常规HE染色，光镜下观察各组滑膜组织形态及免疫组化检测；剩余标本分装于5 mL离心管中，放入-80 ℃冰箱冻存备用，为后续western blot检测做准备。

2.6 滑膜组织HE染色

将各组滑膜组织切片置二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10 min；100%Ⅰ、100%Ⅱ、90%、80%、70%梯度乙醇中各5 min，蒸馏水中5 min；水化后放入苏木精中8 min，使细胞着色；自来水冲洗掉多余的苏木精染液，滴加伊红进行染色，2 min，水洗；95%乙醇脱水2 min、二甲苯透明5 min，各2次；中性树胶封片，显微镜下观察并拍照记录。

2.7 免疫组织化学检测IL-1β与TNF-α的炎性表达

脱蜡：将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10 min；水化：100%Ⅰ、100%Ⅱ、90%、80%、70%梯度乙醇中各5 min，蒸馏水中5 min；置于枸橼酸缓冲液中抗原修复，修复过程：微波炉中高温3 min后转低温20 min，自然冷却至室温，PBS(0.01 mol/L、 pH =7.4)漂洗20次，各3 min；滴加阻断内源性过氧化物酶—封闭液—一抗—生物素标记山羊抗兔IGg聚合物—辣根酶标记链霉素卵白素工作液；DAB显色，蒸馏水冲洗后滴加苏木素染液进行复染；脱水、透明、封片、阅片并拍照记录。

2.8 蛋白免疫印迹法检测NF-κB和p38的蛋白表达

各组称取100 mg滑膜组织放入研钵中，不断加入液氮以保持组织脆性，将其充分研磨至粉末状；把样本与1 mL含1 mmol/L PMSF的蛋白裂解液充分混匀后，为使蛋白充分裂解需放置于4 ℃冰箱内静置40 min；12 000 r/min，4 ℃低温离心10 min，收集上清液，用BCA法测定各组样品的蛋白浓度；SDS-PAGE技术分离蛋白，转至PVDF膜上，配置5%脱脂奶粉封闭液50 mL，室温摇床上封闭1 h；TBST缓冲液洗膜3次，5 min/次，然后将膜转入自封袋中，加入一抗2 mL进行孵育，封口后放入4 ℃冰箱过夜；TBST缓冲液洗膜3次，5 min/次，加入二抗，室温孵育2 h；再次洗膜除去二抗，滴入ECL发光液2 min后，凝胶成像系统显影并分析条带灰度值。

2.9 统计学分析

3 结果

3.1 光镜下观察各组家兔滑膜组织HE染色形态学变化

与正常组相比，模型组的滑膜细胞增多、排列紧密，组织明显增厚，全层均有大量炎细胞浸润和成纤维细胞增生，且有血肿与血管生成；与模型组相比，阳性组、早期苗熏组和苗药熏蒸组的滑膜细胞排列较为疏松，组织增生程度减轻，但仍有少量的炎性细胞浸润和血管生成。如图1所示。

3.2 免疫组织化学检测IL-1β与TNF-α的炎性表达

与模型组相比，正常组、阳性组、早期苗熏组和苗药熏蒸组滑膜细胞IL-1β和TNF-α的IOD值均低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；阳性组、早期苗熏组和苗药熏蒸组三组间滑膜细胞IL-1β和TNF-α的IOD值，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2、图3。

组别IL-1βTNF-α正常组36.56±3.51*31.04±5.13*模型组102.97±8.6790.57±8.06阳性组49.99±3.55*46.29±5.45*早期苗熏组82.48±9.38*#76.44±9.73*#苗药熏蒸组63.96±4.99*#58.05±6.51*#

注：与模型组相比，*P<0.05；与阳性组相比，#P>0.05。

图1 各组滑膜组织HE染色结果(×200)

图2 各组滑膜组织IL-1β和TNF-α免疫组化(×200)

注：与模型组相比，*P<0.05；与阳性组相比，#P>0.05

3.3 蛋白免疫印迹法检测NF-κB和p38的蛋白表达

与模型组相比，正常组、阳性组、早期苗熏组和苗药熏蒸组滑膜组织中NF-κB和p38的蛋白表达水平均低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；阳性组、早期苗熏组和苗药熏蒸组3组滑膜组织中的NF-κB和p38蛋白差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图4、图5。

组别NF-κB/β-actinp38/β-actin正常组0.35±0.08*0.43±0.10*模型组1.51±0.221.45±0.03阳性组0.51±0.09*0.43±0.06*早期苗熏组0.53±0.23*#0.52±0.01*#苗药熏蒸组0.55±0.09*#0.51±0.03*#

注：与模型组相比，*P<0.05；与阳性组相比，#P>0.05。

注：与模型组相比，*P<0.05；与阳性组相比，#P>0.05

4 讨论

膝关节滑膜炎属中医“痹证”“伤筋”“鹤膝风”范畴，是因风、寒、湿、热邪气侵袭关节，加上外伤、劳损等外部诱因，造成局部气血运行不畅、正气亏虚，使水湿之邪乘虚而入[7]。中医学认为，滑膜炎积液是由筋脉闭阻、浊湿流注关节所致，且关节腔内积血积液，易瘀久化热、湿热相持，使关节出现肿胀、皮温升高、筋肉拘挛、屈伸不利甚至僵硬等症状[8]。洪素兰认为，膝关节滑膜炎看似局部病变，实与内脏、精、气、血、阴阳密切相关，其基本病机为“肝脾肾亏虚，痰湿瘀血阻滞”，肝脾肾虚为其本，痰湿瘀阻滞为其标[9]。所谓“不通则痛”，熏蒸疗法正是从病理上治疗此症，通过皮肤渗透，从而扩张血管，促进局部血液循环，增强滑囊内液体吸收，达到消炎止痛、除湿散瘀、舒筋通络的作用，且方法简便易行、疗效确切和无毒副作用等特点，更是体现出浓郁的苗族特色和乡土气息。

骨炎消为黔南、黔东南地区的民间收集验方，由黑骨藤、透骨香、大血藤、小血藤、鸡血藤、飞龙掌血、蜘蛛香、淫羊藿等12味药组成，方中黑骨藤味苦、辛，性凉，具有很好的抗炎和镇痛作用，且疏通筋骨、活血止痛、祛风除湿、解毒；透骨香味辛，性平，具有清热解毒、活血祛瘀、祛风除湿、降气平喘等作用，与蜘蛛香共用可祛风除湿、表出毒邪，使机体祛除“外毒内乱”，恢复正常的状态，同时蜘蛛香还能理气和中、调理脾胃，使气血能够得到不断补充；飞龙掌血，味辛，微苦，性温，归脾、胃经，散瘀止血、祛风止痛、消肿解毒[10-11]。又因“膝者筋之府”，膝关节乃经筋会聚之所，具有连属关节、络缀肢体、主司关节运动的功能。当筋脉失去血液养分，筋脉不荣导致筋脉挛缩，从而导致关节活动功能发生严重障碍。方中大血藤、小血藤和鸡血藤皆为藤本类植物，苗医认为这类植物细长蔓延与人体的筋脉相似，可舒通筋脉、通气散血。其中，大血藤和鸡血藤又具有补血的疗效，为软骨提供必要物质，使肌肉、筋骨得以濡养，从而修复受损滑膜、增强营养补给、减少炎症渗出、促进积液吸收，以解除关节的肿胀、僵硬、疼痛等症状，促进功能改善。故上述药味合用，共奏舒筋活血、消肿止痛、舒筋通络之功[12]。而骨碎补、狗脊、杜仲、仙灵脾均有补肝肾、强筋骨之效，为输送基础物质提供能量。故上述诸药合用，条理有序、互补长短，既能调节内乱、排除毒素，又能打通筋脉、提供“气”“血”，达到治愈疾病的目的，并且疗效显著[13]。课题组前期已经证实骨炎消在治疗骨性关节炎方面具有消炎镇痛、改善功能的作用，且苗族熏蒸疗法在临床适应症中的免疫系统疾病、肌肉骨骼系统结缔组织疾病、皮肤病的聚集度较高，尤以关节炎的治疗效果较为突出[14-15]。

图5 各组滑膜组织NF-κB和p38的蛋白表达

本实验运用熏蒸疗法对KOA家兔模型进行干预治疗，通过滑膜组织相关炎性指标的检测结果，表明骨炎消能够改善模型组的滑膜组织形态，且降低其IL-1β、TNF-α的炎性表达和增加NF-κB、p38的蛋白表达，从而减轻滑膜组织炎症反应，起到对膝关节的保护作用，具有很好的治疗效果和推广价值。但同时，本实验也存在不足之处，虽然通过熏蒸方式可以降低KOA家兔滑膜组织中的炎性因子和蛋白表达水平，但具体作用在膝关节的有效治疗时间和浓度还不明确，需进一步探索，且实验过程中未对各组家兔的体重及膝关节周径、形态、皮温做相应的监测记录，导致其变化无法进行组间对比；早期苗熏组与成模后进行治疗的苗药熏蒸组间无统计学差异，说明早期干预治疗对膝关节滑膜炎的预防效果不明显。