酿酒酵母中基于CRISPR/dCas9 的基因转录调控工具的开发与应用

陈永灿 张建志 司同

（中国科学院深圳先进技术研究院，深圳合成生物学创新研究院，深圳 518055）

酿酒酵母被用于制作面包和酿酒已有数千年的历史，是与人类关系最密切的微生物之一。由于其具有遗传背景清晰、生长迅速、抗逆性高、无噬菌体污染等优势，在生物制药、食品、化工和能源等领域均有广泛应用［1-2］。同时，酿酒酵母还是现代分子和细胞生物学研究的真核模式生物。

基因编辑和转录调控工具在酿酒酵母的基础研究和工业应用中起着十分重要的作用。细菌和古细菌中存在CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系统，可以特异性地降解外源遗传物质，进行适应性免疫防御。近年来，该系统被广泛开发应用于包括酿酒酵母在内不同物种的基因编辑［3-6］。CRISPR/Cas9 系统由核酸内切酶Cas9（CRISPRassociated protein 9）、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活RNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）组成。其中，crRNA 与tracrRNA 形成二级结构并招募Cas9蛋白；crRNA 和tracrRNA 也可以融合为向导RNA（guide RNA，gRNA）以简化操作。Cas9 蛋白与核酸结合的复合体可以特异性结合到PAM（Photospacer adjacent motif，NGG）位点相邻并与crRNA 互补的DNA 序列。接着，Cas9 内切酶的HNH 结构域切割与crRNA 互补的DNA 链，RuvC 结构域切割另一条DNA 链，形成DNA 双链断裂（double-strand break，DSB），断裂位点位于PAM 位点上游三个核苷酸的位置［7］。同源重组（Homologous recombination，HR）是酿酒酵母中主要的DNA 修复方式。同源片段存在时，通过CRISPR/Cas9 特异性引入DNA 双链断裂，可对酿酒酵母基因组进行精准的敲除、敲入和突变［8-9］。

除基因编辑外，CRISPR 系统在转录调控、表观遗传编辑、碱基编辑和细胞成像等方面也有广泛应用［10-12］。这些应用主要基于核酸内切酶活性缺陷的dCas9（Nuclease-deficient Cas9）蛋白，而这一突变体通过在Cas9 的RuvC 和HNH 结构域分别引入D10A 和H840A 突变获得［13］。……