养殖场除臭酵母发酵条件的优化

许丽娟 王升平 雷平 王玉梅 于志敏 李荣

摘 要：为了规模化生产除臭酵母菌JM-1，以菌体活菌数为指标，通过单因素试验和正交试验对其发酵条件进行了优化。结果表明：酵母菌JM-1的最佳發酵条件为：培养温度30℃，初始pH值 5.0，接种量4%，500 mL三角瓶装液量150 mL。在此条件下培养24 h，酿酒酵母的发酵菌数超过7.42×108 CFU/mL，与优化前的6.11×108 CFU/mL相比较，活菌数提高了21.1%。

关键词：酵母菌;发酵条件;正交试验;发酵菌数

中图分类号：Q939.99文献标识码：A文章编号：1006-060X（2020）03-0001-03

Abstract： In order to obtain the optimal fermentation condtions of a strain of JM-1， the fermentation conditions were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment， using the number of viable bacteria in the fermentation as an index. The optimal fermentation conditions were： culture temperature 30℃， initial pH value 5.0， inoculum size 4%， and liquid filling quantity 150 mL in the 500 mL conical flask. In these conditions， the number of viable bacteria exceed 7.42×108 CFU/mL， which was increased by 21.1% compared to that before optimization.

Key words： saccharomycetes; fermentation conditions; orthogonal experiment; the number of viable bacteria

随着我国农业和农村经济的结构调整，养殖业朝着规模化、集约化的方向快速发展。但由其规模化养殖所产生的大量废弃物引起的恶臭污染却成为主要污染源[1]。它不仅影响畜禽的正常生长，而且还影响养殖区及周边农村的生态环境，已成为制约畜牧业可持续发展的瓶颈[2]。美国、德国等一些发达国家在几十年前就开始对恶臭污染进行了研究和治理，取得了较多的成果[3]。近年来，我国养殖业虽然在废弃物无害化处理和资源化利用方面取得了明显的成果，但臭气污染问题却未得到解决[4]。养殖场的恶臭气体对人畜健康影响最大的主要是氨气（NH3）和硫化氢（H2S）。这些有害气体如果得不到及时处理或处理不彻底，将会给养殖人员带来不快、引起人和家畜的呼吸道疾病，而且进入大气后会造成酸雨和增加自然生态系统中氮的负荷，具有大气污染和有害气体污染两重性。因此，如何有效的减少养殖场的恶臭成为人们关注的热点问题。

目前恶臭治理的方法有化学法、物理法和生物除臭法，或是这几种方法的组合。而生物除臭法因具有广泛适用范围、较低的运行费用、便于维护管理以及不会产生二次污染等优点，成为脱臭技术的发展方向[5]。

酵母菌在有氧或无氧的条件下都能生存，具有良好的生态适应性。它在厌氧条件下产生的乙醇能有效抑制有害微生物的活动，同时散发出的酒香味还可以掩盖部分臭味[1]，因此其可在养殖场恶臭气体治理方面发挥重要作用。在前期研究的基础上，以前期筛选到的除臭酵母JM-1为材料，通过单因素试验和正交试验初步优化其发酵条件，以期为菌剂的规模化生产和实际应用提供理论依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌 种 试验所用除臭酵母为酿酒酵母（JM-1），由湖南省微生物研究院环保微生物室自行分离和保存。

1.1.2 培养基 种子培养基：葡萄糖 20.0 g/L，酵母膏 10.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，蒸馏水配制，pH值6.2～6.4;发酵培养基：蔗糖 2%，磷酸二氢钾 0.1%，氯化钠 0.01%，硫酸镁 0.05%，麦芽汁 0.3%，硫酸铵 0.5%，氯化钙 0.01%，酵母浸膏 0.02%，其余为水，pH值6.0～6.2。

1.2 除臭酵母JM-1最佳发酵条件的确定

1.2.1 最佳培养温度的确定 将酵母JM-1按1%接种量接于装有100 mL YPD培养基容量为500 mL的三角瓶中，分别置于20、25、30、35、40 ℃5个不同温度，转速为180 r/min的摇床培养24 h，用平板计数法计数活菌数。

1.2.2 最佳初始pH值的确定 将基础培养基的pH值分别调节为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，按1%的接种量进行接种，选择单因素试验确定的最佳温度，180 r/min培养24 h后计数活菌数。

1.2.3 最佳接种量的确定 在获得最佳初始pH值和培养温度以后，分别按照2%、4%、6%、8%、10%的接种量进行接种，在单因素试验确定的最佳温度，180 r/min条件下培养24 h后计数活菌数。

1.2.4 最佳装液量的确定 按最佳接种量分别接入装有10、100、150、200、250 mL YPD培养基容量为500 mL的三角瓶中，选择最佳温度，180 r/min培养24 h。

1.3 除臭酵母JM-1发酵条件正交优化试验

发酵条件优化采用4因素3水平L9（34）正交试验，共设有9个处理，每个处理有3个重复试验。根据单因素试验的结果，选择培养温度、初始pH值、接种量、装液量做正交试验，筛选出优化组合。

1.4 活菌数

活菌数采用平板涂布法计数。

1.5 数据分析

试验数据运用SPSS18.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 最佳培养温度 不同温度对酵母JM-1生长的影响结果如图1所示，JM-1在25～35℃内生长良好，菌体数也较高，在30℃时菌体数最高，为5.85×108 CFU/mL。低于或高于该温度范围，菌体长势差，菌体数量低，这可能是由于温度较低时，微生物生长缓慢，代谢活性差，因此菌体量少;高温时，菌体的代谢活动受到抑制，从而影响菌株的生长和繁殖，导致菌量少。从图1可看出，JM-1的最佳生长温度为30℃。

2.1.2 最佳初始pH值 由图2可知，当培养基初始pH值为7.0时，JM-1菌株长势差;而初始pH值为5.0时，菌体生长最好，活菌数达6.00×108 CFU/mL;且初始pH值为3.0～4.0时，菌体生长依然旺盛，活菌数也高。说明该菌株在低pH值下也能生长良好。

2.1.3 最佳接种量 在获得最佳初始pH值和培养温度后，对菌株分别采用5个接种量（2%、4%、6%、8%、10%），180 r/min，培养24 h，测定菌数。结果见图3，一定范围内，菌株发酵的菌数随着接种量的增加而增加，当接种量超过6%时，活菌数出现下降趋势。在接种量为2%和4%时，活菌数分别为5.93×108 CFU/mL和6.11×108 CFU/mL，相差不大。从经济角度出发，可选择2%的接种量。

2.1.4 最佳装液量 装液量对酵母菌体数的影响实际上反映的是溶解氧对酵母菌体数的影响。装液量对酵母JM-1菌体数的影响见图4，由图可知，菌液装量为100 mL时，菌体数达6.05×108 CFU/mL。当在容量为500 mL的三角瓶中装入50～250 mL培养液时，菌体均能很好的生长。但随着装液量增多，活菌数略有下降。由此可见，装液量虽然对菌体的生长有影响，但影响不大，这也在一定程度上说明该菌在有氧和缺氧条件下都能生长。

2.2 正交试验结果

在以上单因素试验的基础上，综合考虑各发酵条件对酵母JM-1脱氨性能影响，为了得出初步优化的发酵条件，以活菌数为指标，设置L9（34）正交表进行优化试验，共9个处理，每个处理重复3次。因素及水平设计见表1，正交试验结果见表2。

由表2的试验结果可知，菌株JM-1发酵条件的最佳组合为A2B2C2D2（最优组合未在正交试验组合中），即培养温度30℃，初始pH值 5.0，500 mL三角瓶装液量150 mL，接种量4%，培养24 h，酵母的发酵菌数超过7.42×108 CFU/mL。根据表2的试验结果进行方差分析，结果见表3。由表2的极差分析和表3的方差分析可知，所考察的各个因子中初始pH值和接种量对活菌数的影响相当大，均达到极显著水平。其中，影响酵母JM-1活菌数的主次因素依次为：接种量>装液量>初始pH值>培养温度，即D因素（接种量）为影响酵母菌体数的最主要因素，其次是C因素（装液量）和B因素（初始pH值），而A因素（培养温度）的影响最小。

3 结论与讨论

畜禽养殖已成为农村经济新的增长点和重要的支柱产业。随着各地规模化的畜禽养殖业迅速发展，畜禽养殖业的环境污染总量、污染程度也发生了极大变化。畜禽养殖业所产生的恶臭污染已成为不可忽视的重大污染源。

在没有人工干预的情况下，对环境中污染物进行降解主要是依赖环境中本身存在的土著微生物进行自然净化，但微生物生长缓慢导致降解速度慢。因此，直接接种培养驯化后的菌种可加速污染物的降解[6-8]。

该文将前期获得的养殖场除臭酵母菌JM-1的发酵温度、初始pH值、装液量和接种量进行优化试验。单因素试验研究表明，酵母菌JM-1在培养温度25～35℃，初始pH值在4.0～6.0内均能很好的生长。对发酵条件进行正交试验，获得最佳发酵工艺条件为：培养温度 30℃，初始pH值5.0，500 mL锥形瓶装液量150 mL，接种量4%。在此条件下培养24 h，酵母菌的发酵菌数超过7.42×108 CFU/mL。与优化前的6.11×108 CFU/mL相比较，活菌数提高了21.1%。

参考文献：

[1] 杨 柳，邱艳君. 除臭菌株对畜禽养殖场恶臭气体的控制研究[J]. 中国沼气，2014，32（3）：36-39.

[2] 韩昆鹏，杨 凌，卞红春，等. 微生物除臭技术在畜禽养殖臭气治理中的研究应用进展[J].山东畜牧兽医，2019，40（7）：74-77.

[3] 邓素芳，杨有泉，陈 敏. 畜禽养殖舍臭气控制研究进展[J]. 中国畜牧杂志，2010，46（22）：48-51.

[4] 皮劲松，张 昊，万绪波. 蛋鸡养殖场臭气产生与治理[J]. 养殖与饲料，2019（1）：8-10.

[5] 申彦晶，饶力群，任 杰. 降氨除臭芽孢杆菌的筛选鉴定及其氮素迁移过程[J]. 微生物学通报，2015，42（7）：1234-1240.

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[7] 白 瑞，胡 陽，雷振宇，等. 复合微生物制剂在环保领域中的应用[J]. 应用化工，2017，46（5）：1002-1006.

[8] 李晓楼. 石油污染土壤的土著微生物修复影响因素研究[J].长江大学学报（自科版），2014，11（22）：25-27.

（责任编辑：唐珊珊）